グリコプロテオミクスと抗体医薬品研究の急速な発展に伴い、糖鎖修飾も大きな注目を集めています。細胞と細胞、細胞と病原体との接触は主に糖とタンパク質の相互作用によって行われ、糖鎖修飾は複合糖質の接着特性を決定します。IgGでは、Fc領域のAsn297に保存されたN結合型糖鎖もその活性に重要です。また、一部の抗体には追加のNグリカンがあり、Fc領域のAsn297の保存部位とともに、抗体の認識、半減期、免疫応答に影響を与えます。
タンパク質の糖化は、タンパク質の特定の部位で糖鎖が結合する複雑な翻訳後修飾です。糖鎖の種類に応じて、糖タンパク質はN結合型糖タンパク質、O結合型糖タンパク質などに分類されます。また、タンパク質の糖化は、宿主細胞の種類や発酵条件（培地、pH値、温度など）の影響も受けます。そのため、糖タンパク質は通常、糖化部位、糖化レベル、糖鎖の特定の構造など、糖化パターンに不均一性があり、糖鎖の分析と構造特性評価の作業が非常に困難になっています。糖鎖構造情報を最大限に得るために、糖鎖分析の主な戦略は、まずタンパク質から糖鎖を解放し、その後詳細な分析と特性評価を行うことです。この戦略では、効率的で正確で安定した脱糖鎖法が重要です。
現在、脱グリコシル化には酵素法が広く使用されています。
糖タンパク質は、グリカン鎖の種類に基づいて、N 結合型糖ペプチドと O 結合型糖ペプチドに分類できます。N 結合型糖ペプチドの場合、一般的に使用される酵素には、ペプチド N グリコシダーゼ F (PNGase F)、エンドグリコシダーゼ H (Endo H)、エンドグリコシダーゼ S (Endo S) などがあります。PNGase F は GlcNAc-Asn 結合を加水分解し、高マンノース、複合、ハイブリッド グリカン鎖を除去できます。Endo H は、N グリカン鎖五糖コア内のグリコシド結合を切断します。Endo S は、ネイティブ IgG の重鎖のキトビオース コアから N 結合型グリカンを特に切断します。
図 1. PNGase F、Endo H、Endo S の切断部位。
その中で、PNGase F は、糖タンパク質中のほぼすべての N 結合型オリゴ糖を除去する最も効果的な酵素法であり、アスパラギンで結合した高マンノース、ハイブリッド、複合オリゴ糖糖タンパク質を切断し、特に N 結合型グリカンを除去します。切断部位は、最も内側の N-アセチルグルコサミン (GlcNAc) とアスパラギン残基の間のアミド結合であり、酵素加水分解後にタンパク質上のアスパラギンをアスパラギン酸に変換します。
α1-6 フコースが GlcNAc コアに位置する場合、PNGase F も切断できます。α1-3 フコースが GlcNAc コアに位置する場合のみ (植物および昆虫の糖タンパク質に共通)、PNGase F は切断できません。
しかし、従来の PNGase F 酵素反応では、抗体の N 型糖鎖を放出するのに数時間かかり、糖鎖放出を優先するため、不完全な脱糖鎖により偏った結果が生じる可能性があり、得られた糖鎖分布は治療用抗体の正しい構成を表さない可能性があります。したがって、抗体や抗体融合タンパク質、その他のバイオ治療剤の製造プロセス中の糖鎖形成モニタリングには、正確な N 型糖鎖プロファイルをできるだけ早く取得することが重要です。
高速PNGase F
Fast PNGase F は、抗体、免疫グロブリン、融合タンパク質、その他の糖タンパク質を数分で迅速かつ完全に脱グリコシル化できる最適化された組み換え試薬です。この酵素は、すべての N-グリカンを迅速かつ選択なしに除去でき、下流のクロマトグラフィーまたは質量分析に直接使用できます。
製品の特徴:
高速:数分で完全かつ迅速な脱糖化を実現します。
高純度:プロテアーゼ、グリコシダーゼの混入なし、純度 ≥ 95%。
非選択的:すべての N グリカンを迅速かつ優先的に除去します。
優れた互換性:ダウンストリームクロマトグラフィーまたは質量分析に直接使用されます。
テストデータ:
ワンステップタンパク質脱糖化：
- 10 ug 基質/100 ug 抗体および ddH2O を混合して総容量 16 uL にします。
- 4 μLのFast PNGase Fバッファー（5倍）を加え、最終容量20 uLになります。
- Fast PNGase F を 1 μL 加えます。
- 50℃で10分間インキュベートします。
図 2. タンパク質基質 (A) と抗体 (B) に対するワンステップ酵素切断効果。
1: タンパク質マーカー（Cat#20350ES）2: 競合製品 + 基質または抗体3: 競合製品 + 基質または抗体4:
2段階タンパク質脱糖化：
- 10 ug 基質/100 ug 抗体および ddH2O を混合して総容量 16 uL にします。
- 4 μLのFast PNGase Fバッファー（5倍）を加え、最終容量20 uLになります。
- 80℃で2分間インキュベートし、室温まで冷却します。
- Fast PNGase F を 1 μL 加えます。
- 50℃で10分間インキュベートします。
図 3.タンパク質基質 (A) と抗体 (B) に対する 2 段階酵素切断効果。
1: タンパク質マーカー（Cat#20350ES）2: 競合製品 + 基質または抗体3: 競合製品 + 基質または抗体4:
結論：
-
Yeasen Fast PNGase F は、同じ反応条件下で輸入競合製品と同等以上の酵素切断効率を有します。 - 酵素切断効率を高めるために、2段階の酵素切断を行うことが推奨されます。一部の抗体（Fab Nグリコシル化など）では、予熱ステップが必要です。
効率的な脱グリコシル化のために。
さらに、
購入ガイド
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製品番号 |
20406ES |
20407ES |
20414ES |
20413ES |
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製品名 |
高速PNGase F |
PNGアーゼF |
遠藤 浩 |
遠藤S |
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ソース |
酵母組換え発現 |
酵母組換え発現 |
酵母組換え発現 |
大腸菌 組み換え発現 |
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特定の活動 |
適用できない |
100000U/mL |
1000000U/mL |
8000単位/mg |
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分裂部位 |
ほぼすべてのN結合型グリカン |
ほぼすべてのN結合型グリカン |
N結合型高マンノースグリカン |
IgG重鎖のコア二糖構造内で切断する |
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消化時間 |
10分 |
1～3時間 |
1～3時間 |
1時間 |
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グリコシル化 |
適切な |
適切な |
適切な |
適切な |
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タンパク質構造 |
適切な |
適切な |
適切な |
適切な |
注文情報
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製品名 |
製品番号 |
仕様 |
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20406ES20/50 |
20T/50T |
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20407ES01/02 |
15000 U / 75000 U |
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20414ES92/97 |
10000 U /50000 U |
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20413ES80/90 |
1000 U/5 x 1000 U |