- 背景
このレポートにまとめられたデータは、MycAway TMマイコプラズマ リアルタイム qPCR 検出キット (2G) 製品について
概要データはユーザーの参考用であり、ユーザーは独自のサンプルを使用してマイコプラズマ法を検証し、その方法がユーザーの要件を満たしていることを確認する必要があります。このキットを使用するすべての研究室では、検出限界、特異性、堅牢性などのパラメータを検証することをお勧めします。
検証内容：
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パフォーマンス |
検証パラメータ |
検証結果 |
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検出限界 |
マイコプラズマ株検出限界 |
10種類の薬局方マイコプラズマの検出限界：10 CFU/mL、それぞれ24回テストし、検出率は95%以上です。 |
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特異性 |
サンプルマトリックス干渉 |
9 種類の異なるサンプル マトリックスと DNA 希釈溶液をテストしましたが、マイコプラズマは検出されませんでした。 |
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交差反応性 |
バイオ医薬品で一般的に使用される 14 種類の菌株と 6 種類の細胞工学細胞をテストしましたが、マイコプラズマは検出されませんでした。 |
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耐久性 |
凍結融解安定性 |
キットの性能に影響を与えることなく、20 回の繰り返し凍結融解サイクルに耐えることができます。 |
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熱加速安定性 |
37°C で 14 日間、4°C で 30 日間の条件下でも影響を受けません。 |
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機器の互換性 |
ABI7500、ABI QuantStudio™5、Bio-Rad CFX96、Roche LightCycler®480 と互換性があります。 |
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カバレッジ |
マイコプラズマDNA型の範囲 |
マイコプラズマ 16S rRNA 配列を使用したデータベース比較は、モリクテス綱内の 183 種をカバーしています。 |
- 実験材料と方法
2.1 MycAway TMマイコプラズマ リアルタイム qPCR 検出キット (2G)、ベンダー:
2.2 MolPure TM磁気残留 DNA サンプル調製キット、ベンダー:
2.3 マイコプラズマ感受性標準は Minerva Biolabs (MB) から購入します。同社の菌株は National Collection of Type Cultures (NCTC) から取得しています。感受性標準は不活化マイコプラズマであり、マイコプラズマ検出のための核酸増幅法 (qPCR/PCR 法) の方法論的検証に使用されます。EP 2.6.7 および JP G3 の要件を含む合計 10 種類のマイコプラズマが購入されます。標準の情報は次のとおりです。
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ベンダー |
カタログNo. |
NCTC番号 |
ATCC番号 |
材質名 |
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ミネルババイオラボ（MB） |
102-1003 |
10129 |
23838 |
10CFU ™ 感度標準マイコプラズマ アルギニニ |
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102-2003 |
10112 |
23714 |
10CFU ™ 感度標準マイコプラズマ オラル |
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102-3003 |
10115 |
19610 |
10CFU ™ 感度標準マイコプラズマ ガリセプティカム |
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102-4003 |
10119 |
15531 |
10CFU ™ 感度標準マイコプラズマ肺炎 |
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102-5003 |
10124 |
25204 |
10CFU ™ 感度標準マイコプラズマ・シノビア |
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102-6003 |
10117 |
19989 |
10CFU ™ 感度標準マイコプラズマ ファーメンタンス |
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102-7003 |
10130 |
17981 |
10CFU ™ 感度標準マイコプラズマ・ヒオリニス |
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102-8003 |
10116 |
23206 |
10CFU ™ 感度標準アコレプラズマ レイドラウィー |
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102-9003 |
10164 |
27556 |
10CFU™感度標準スピロプラズマシトリ |
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102-11003 |
10113 |
23064 |
10CFU ™ 感度標準マイコプラズマ サリバリウム |
2.4 オリジナルデータ: 電子版は、親ファイル「MycAway TMマイコプラズマリアルタイム qPCR 検出キット (2G)」のサブファイル「実験レポート」に記録されています。
2.5 方法: 実験に使用した材料と操作方法は、基本的に
- 予選内容と結果
3.1 検出限界（LOD）
10 CFU/mL マイコプラズマ標準株の核酸抽出と検出は、標準株の説明書と抽出および検出キットの説明書に従って実施しました。10 CFU/mL マイコプラズマ標準株について合計 24 回のアッセイが得られました。各実験では、NCS (ネガティブ コントロール サンプル) と NTC (テンプレートなしコントロール) サンプルを同時にテストしました。
結果は、NCS と NTC の結果が満足のいくものであり、24 個の 10 CFU/mL サンプルすべてが陽性であり、24 回のテストのうち少なくとも 23 回が陽性であるという要件を満たしていることを示しました。
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いいえ。 |
材質名 |
細菌液の濃度 |
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1 |
マイコプラズマアルギニニ |
10 CFU/mL |
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2 |
マイコプラズマ・オーラル |
10 CFU/mL |
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3 |
マイコプラズマ・ガリセプティカム |
10 CFU/mL |
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4 |
マイコプラズマ肺炎 |
10 CFU/mL |
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5 |
マイコプラズマ・シノビエ |
10 CFU/mL |
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6 |
マイコプラズマ・ファーメンタンス |
10 CFU/mL |
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7 |
マイコプラズマ・ヒオリニス |
10 CFU/mL |
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8 |
アコレプラズマ・レイドラウィ |
10 CFU/mL |
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9 |
スピロプラズマ・シトリ |
10 CFU/mL |
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10 |
マイコプラズマ・サリバリウム |
10 CFU/mL |
表1 検証された株に関する情報
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10 CFU/mL |
実験1 |
実験2 |
実験3 |
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検出率 |
8/8 |
8/8 |
8/8 |
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合計 |
24/24 |
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表2 検出限界結果
3.2 特異性
3. 2 . 1 マイコプラズマ検査範囲
キット内のプライマープローブ配列をデータベース内の16S rRNAゲノムと比較し、バイオインフォマティクス分析により、NextSense Biologicals社のMycAway TMマイコプラズマqPCR検出キット（プローブ法）は、マイコプラズマ120種、ウレアプラズマ9種、スピロプラズマ33種、コレストロンギラ7種など、少なくとも183種の褐虫藻をカバーできることが判明しました。
3. 2 . 2 サンプルマトリックス干渉
9 つの基質 (ダルベッコ MEM、ハム F-10 培地、M-199 培地、ハム F-12K カイグン、RPMI-1640 培地、マッコイ 5A、ハム F-12K カイグン + 1.0 mM/L グルタミン、L-15 LEIBOVITZ MEDTA + 2.05 mM L-グルタミン、DMEM 低グルコース標準培地) をサンプルとして使用してサンプル マトリックス干渉を検証したところ、培地はキット試薬に干渉しないことがわかりました。
3. 2 . 3 フレキシバクテリア検出範囲
NCS および NTC サンプル テストとともに、10 CFU/mL の不活化マイコプラズマ (Mycoplasma arginini、Mycoplasma orale、Mycoplasma gallisepticum、Mycoplasma pneumoniae、Mycoplasma synoviae、Mycoplasma fermentans、Mycoplasma hyorhinis、Acholeplasma laidlawii、Spiroplasma citri、Mycoplasma salivarium) の抽出と検出が必要です。
結果は、NCS と NTC は検出されず陰性であり、マイコプラズマ 10 種すべてが検出され陽性でした。
3. 2 . 4 交差反応
クロストリジウム（ウェルシュ菌、アセトブチリカム菌）、ラクトバチルス（アシドフィルス菌）、連鎖球菌（ミュータンス菌、肺炎球菌）、その他の一般的なバチルス・球菌・真菌微生物（表皮ブドウ球菌、アシネトバクター・バウマニ、エンテロバクター・アエロゲネス、ミクロコッカス・ガルシニア、緑膿菌、緑膿菌、サルモネラ・エンテリカ・エンテリティディス亜種エンテリカ、枯草菌、枯草菌、バチルス属菌、セレウス菌）、および6つの遺伝子組み換え細胞（HEK293、 293T、Vero、CHO、E.coli、SF9などの大腸菌株を、MolPure TM磁気ビーズ法残留DNAサンプル前処理キット（ボトル）およびMycAway TMマイコプラズマqPCR検出キット（プローブ法）（2G）を使用してマイコプラズマ検出に使用し、各実験はPCS、NCS、およびNTCサンプルテストと同時に実行しました。
結果は、PCS、NCS、および NTC の結果が満足のいくものであり、テスト サンプルは陰性であり、交差反応は発生しなかったことを示しました。
3.3 堅牢性
3. 3.1凍結融解安定性
マイコプラズマ検査キットは、-25℃～-15℃の条件下で凍結融解実験を実施し、20回の凍結融解の繰り返しに耐えることができ、性能に影響がないことが確認されました。
3. 3 . 2 加速された安定性
マイコプラズマ検出キットは、それぞれ37℃で14日間、4℃で30日間加熱加速試験を実施しましたが、製品の性能に影響は見られませんでした。
3. 3 . 3 機器の適用範囲
マイコプラズマ検出キットでは、キット内の異なる濃度の陽性対照とマイコプラズマ肺炎DNAを試験サンプルとして使用し、それぞれThermo Scientific ABI7500、Thermo Scientific ABI Q5、Shanghai Hongshi SLAN-96S、およびRoche LightCycler®480の4つの異なるブランドとモデルで実験を行いました。実験は、Shanghai Hongshi SLAN-96SとRoche LightCycler®480の4つの異なるブランドとモデルのqPCR機器で実施しました。
結果は、検査対象のサンプルが異なるメーカーのモデルの qPCR 機器で検出され、ネガティブコントロールの結果が適格であり、キットの性能に影響がなかったことを示しました。
- 4 .参照
4.1 マイコプラズマ検査法 <3301>. 中国薬局方、第3部 [S]. 北京：中国科学技術出版社、2020：542-543。
4.2分析法のバリデーションガイドライン<9101>。中国薬局方、第3部[S]。北京：中国科学技術出版社、2020：682。
4.3 医薬品の微生物学的試験の代替法の検証に関するガイドライン <9201>。中国薬局方、第3部 [S]。北京：中国科学技術出版社、2020：684。
4.4 マイコプラズマ. 欧州薬局方[S]. 第10版、2020年：セクション2.6.7、194-199。
4.5 バイオテクノロジー応用医薬品／生物起源由来医薬品の製造に使用される細胞基質のマイコプラズマ試験 <G3-14-170>. 日本薬局方[S]. 第18版, 2021: 2678-2682.
4.6 Erica J. Fratz-Berilla、Phillip Angart、Ryan J.Graham、et al. CHO細胞バイオリアクター培養で生産されたモノクローナル抗体の意図的なマイコプラズマ汚染イベント中の製品品質特性への影響。バイオテクノロジーとバイオエンジニアリング。2020;117(9): 2802-2815。
4.7 Dmitriy V. Volokhov、Laurie J Graham、Kurt A Brorson、Vladimir E Chizhikov。細胞基質および生物製剤のマイコプラズマ検査：代替の非微生物学的技術のレビュー。Mol Cell Probes。2011年4月-6月;25(2-3):69-77。
4.8 AL Ingebritson、CP Gibbs、C. Tong、GB Srinivas。動物用ワクチンおよび生物学的製剤のマイコプラズマ汚染を検査するためのPCR検出法。Lett in Applied Microbiology。2015年2月;60(2):174-180。
注文情報
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説明 |
部品番号 |
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18461ES |
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| MycAway™ マイコプラズマ qPCR 検出キット (2G) | 40619ES |