Ct値は、蛍光定量PCRにおける重要な結果表現です。遺伝子発現レベルまたは遺伝子コピー数の差を計算するために使用されます。では、蛍光定量において、どの範囲のCt値が妥当であると考えられますか？Ct値が有効な範囲内に収まるようにするにはどうすればよいでしょうか？今日は、Xiao Yiが皆さんに代わってこの質問に答えましょう。
Ct値とは何ですか?
qPCR 増幅プロセスにおいて、Ct 値は、増幅された産物の蛍光信号が設定された蛍光閾値に達する増幅サイクル数 (サイクル閾値) を指します。「C」はサイクル、「T」は閾値を表します。簡単に言えば、Ct 値は、qPCR の開始テンプレートが一定量の産物に達するのにかかるサイクル数です。これについては後で詳しく説明します。
Ct値の機能は何ですか?
1. 指数関数的増幅、テンプレート量、Ct値の関係
理想的なシナリオでは、qPCR 中に遺伝子は指数関数的に増幅され、特定のサイクル数にわたって蓄積されます。増幅サイクル数と産物の量の関係は、次のように表すことができます。増幅産物の量 = 初期テンプレート量 × (1 + En)^サイクル数。ただし、qPCR 反応は常に理想的な条件下で発生するわけではありません。増幅産物の量が「特定の産物量」に達すると、この時点でのサイクル数が Ct 値となり、指数関数的増幅の期間を示します。Ct 値と初期テンプレート量の関係は次のとおりです。テンプレートの Ct 値とそのテンプレートの初期コピー数の対数の間には線形関係があります。初期テンプレートの濃度が高いほど Ct 値は低くなり、初期テンプレートの濃度が低いほど Ct 値は高くなります。
2.増幅曲線、蛍光閾値、および特定の生成物量
qPCR 増幅産物の量は、蛍光信号の形で直接表され、増幅曲線として知られています。PCR の初期段階では、増幅が理想的な条件下にあり、サイクル数が少ないため、産物の蓄積は最小限で、生成される蛍光のレベルはバックグラウンドの蛍光ノイズと有意に区別できません。その後、蛍光の生成は指数関数段階に入ります。反応が指数関数段階に入ったばかりの特定の時点で PCR 産物の量を検出できます。これを「特定の産物量」と呼びます。これを使用して、テンプレートの初期内容を推測できます。したがって、特定の産物量に対応する蛍光信号強度は、蛍光閾値として知られています。
PCR の後期段階では、増幅曲線は指数関数的な増幅を示さなくなり、線形段階とプラトー段階に入ります。
3.Ct値の再現性
PCR サイクルが Ct 値が発生するサイクル数に達すると、真の指数関数的増幅段階に入ります。この時点では、小さなエラーは増幅されていないため、Ct 値の再現性は優れています。つまり、同じテンプレートを異なる時間に増幅しても、異なるチューブで同時に増幅しても、得られる Ct 値は一定のままです。 
Ct値の範囲はどのくらいですか?
1.増幅効率En
PCR 増幅効率とは、ポリメラーゼが標的遺伝子を増幅産物に変換する効率を指します。1 つの DNA 分子が 2 つの DNA 分子に変換される場合、増幅効率は 100% です。増幅効率は一般に En と表記されます。以降の記事での分析の便宜上、増幅効率に影響を与える要因について簡単に紹介します。
| 影響要因 | 説明 | 判決 |
| A. PCR阻害剤 | 1. テンプレート RNA には、タンパク質や洗剤など、PCR 反応を阻害する物質が含まれている場合があります。 2. 逆転写後に得られた cDNA には、テンプレート RNA と逆転写試薬の成分が高濃度に含まれている可能性があり、これも後続の PCR を阻害する可能性があります。 |
1. 汚染の存在は、A260/A280 比と A260/A230 比を測定するか、RNA 電気泳動を実行することによって評価できます。 2. 逆転写後、cDNAが一定の割合で希釈されているかどうか。 |
| B. 不合理なプライマー設計 | プライマーは効果的にアニールできません。 | プライマーに二量体やヘアピン構造があるかどうか、また不一致があるかどうかを確認します。イントロンにまたがる設計に注意を払う必要がある場合もあります。 |
| C.不適切な反応手順 | 1. プライマーが効果的にアニールできません。 2. DNAポリメラーゼの活性が十分に発揮されない。 3. 高温が長時間続くと、DNAポリメラーゼの活性が低下します。 |
1. アニーリング温度がプライマーのTm値よりも高い。 2. 変性前の時間が短すぎます。 3. 反応プロトコルの各段階の所要時間が長すぎます。 |
| D.試薬が完全に混合されていない、またはピペッティングエラー | 反応システムでは、PCR 反応成分の局所濃度が高すぎるか不均一であるため、PCR が非指数関数的に増幅されます。 | / |
| E.アンプリコンの長さ | アンプリコンの長さが長すぎて 300 塩基対を超えているため、増幅効率が低くなります。 | アンプリコンの長さが 80 塩基対から 300 塩基対の間であるかどうかを確認します。 |
| F.qPCR試薬の影響 | 試薬中の DNA ポリメラーゼの濃度が低い場合、またはバッファー内のイオン濃度が最適ではない場合、Taq 酵素は最大活性に達しません。 | 標準曲線はプライマーの増幅効率を測定するために使用されます。 |
2.Ct値の範囲
Ct 値の範囲は 15 ～ 35 です。15 未満の Ct 値はベースライン フェーズ内にあるとみなされ、蛍光閾値に達していません。理想的には、Ct 値とテンプレートの初期コピー数の対数との間には直線関係があり、これは標準曲線と呼ばれます。標準曲線を使用すると、増幅効率が 100% の場合、遺伝子の単一コピーを定量化する Ct 値は約 35 と計算されます。Ct 値が 35 より大きい場合、理論的にはテンプレートの初期コピー数は 1 未満であり、統計的に重要ではないと見なすことができます。 
異なる遺伝子の場合、遺伝子コピーの初期テンプレート量と増幅効率の変動により Ct 値の範囲が変化するため、遺伝子の線形検出範囲を計算するには、その遺伝子の標準曲線を作成する必要があります。
3. Ct値に影響を与える要因
増幅サイクル数と産物の量の関係（増幅産物の量 = 初期テンプレートの量 × (1 + En)^サイクル数）からわかるように、理想的な条件下では、初期テンプレートの量と En が Ct 値に影響を与えることがわかります。テンプレートの品質や増幅効率の違いにより、Ct 値が高すぎたり低すぎたりすることがあります。
4. Ct値が高すぎるか低すぎる
Xiao Yi は、当社の技術部門の専門家に相談し、Ct 値に関する 2 つの一般的な問題の原因と解決策をまとめ、読者にわかりやすく説明しました。
| 問題 | 原因 | ソリューション |
| Ct値が高すぎる | テンプレート濃度が低いか、PCR 阻害物質が存在します。 増幅効率が低い。 |
1. テンプレートの濃度を上げるか、RNA または cDNA の希釈率を上げるか、テンプレートを再度準備します。 2. アニーリング温度を下げるか、2 段階増幅法を使用するか、コンポーネントとシステムが完全に混合されていることを確認するか、反応プロトコルを最適化するか、試薬を交換してみてください。 |
| Ct値が低すぎる | 1. テンプレートの高濃度 2. NTC（テンプレートコントロールなし）およびNRC（リバースコントロールなし）の汚染 3. 不適切なプライマー設計 |
1. テンプレート RNA の量を減らすか、cDNA をより高い比率で希釈します。 2. すべての試薬を新しく交換するか、UDGase 汚染防止試薬を使用します。 3. 非特異的増幅を避けるために手順を最適化します。 |
これで、この問題の異常な Ct 値の原因の分析は終了です。次に、Xiao Yi が、実験データの精度と信頼性を高めるために、コスト効率の高いさまざまな製品をお勧めします。ぜひお気に入りを選んでください。
| 製品名 | 猫＃ | サイズ |
| Hieff UNICON™ ユニバーサルブルー qPCR SYBR グリーンマスターミックス | 11184ES08 | 5×1mL |
| Hifair™ Ⅲ 1st Strand cDNA 合成スーパーミックス qPCR 用 (gDNA ダイジェスター プラス) | 11141ES60 | 100トン |
| Hifair™ AdvanceFast ワンステップ RT-gDNA 消化スーパーミックス (qPCR 用) | 11151ES60 | 100トン |
| Hifair™ AdvanceFast 1st Strand cDNA 合成キット (染料なし) | 11150ES60 | 100トン |