蛍光定量PCR（qPCR）は、遺伝子発現解析、遺伝子型判定、病原体検出、SNP解析などに応用できる、研究室でよく使われる技術です。qPCRの操作はシンプルで、原理も理解しやすいです。しかし、山積みの乱雑なデータに直面して、結果をどのように分析するかは、大変な作業になります。今日は、Xiao Yiが複雑なプロセスを簡素化し、SCIジャーナルに掲載できるデータを簡単に取得する方法をご案内します。
qPCR で使用される一般的な分析方法には、相対定量と絶対定量があり、これらの方法の選択はさまざまな実験設計に基づいて行う必要があります。今回は、一般的に相対定量法が選択される qPCR の一般的なアプリケーションである遺伝子発現分析に焦点を当てます。
実験デザイン
現在、光誘導がシロイヌナズナ AtSUC2 遺伝子の発現に与える影響を研究する必要があるとします。コントロール グループは、何の処理も受けていないシロイヌナズナ植物で構成され、実験グループは、特定の光誘導処理を受けた植物です。両方のグループから RNA を抽出し、逆転写して cDNA を取得し、これをテンプレートとして使用します。シロイヌナズナ GAPDH 遺伝子は、qPCR 実験の内部参照として選択されます。
セットアップする必要がある qPCR ウェルは次のとおりです。
1) NTC (No Template Control) は、PCR システムに汚染があるかどうかを確認するために使用されます。
2) NRT (逆転写なし) とは、逆転写を受けていない RNA をテンプレートとして使用し、gDNA 汚染のコントロールとして機能することを意味します。
3)内部参照遺伝子は、サンプルの初期濃度の変化によって生じる差異を補正するために使用されます。
4)対照サンプルの選択は、一般的に以下のカテゴリーに分類されます。
- 特定の処理が遺伝子発現に及ぼす影響を評価するために、未処理のサンプルを参照サンプルとして使用します。
- 異なる時間における遺伝子発現の違いを検出するために、時間 0 のサンプルを参照サンプルとして使用します。
- 異なる組織間の遺伝子発現の違いを比較するために、1 つの組織を参照サンプルとして任意に選択します。
ここで注目すべき点は、上記の各材料に対して、3 つの PCR ウェル (1、2、3) が設定されていることです。これらは PCR 複製であり、テクニカル レプリケートとも呼ばれ、操作エラーを排除し、増幅効率を正確に評価することを目的としています。さらに、生物学的レプリケートを確立する必要があります。これには、異なる材料 (異なる時間、植物、バッチ、反応プレート) で同じ実験を実施して、生物学的変動を較正し、処理に統計的有意性があるかどうかを分析することが含まれます。具体的には、この場合、実験グループとコントロール グループの両方で、少なくともさらに 2 セットの Arabidopsis サンプル (A、B、C) を処理する必要があります。各セットから RNA を抽出して逆転写し、qPCR を実行します。統計分析には、3 つの生物学的レプリケートの平均が使用されます。
結果分析 - ΔΔCt法
ΔΔCt法の特徴は、計算にCt値のみを使用する点ですが、前提として、標的遺伝子と参照遺伝子の増幅効率が比較的一定で、両者が90～110%の範囲内に収まっている必要があります。
具体的な計算式は以下のとおりです。
ΔCt = Ct (標的遺伝子) - Ct (参照遺伝子)
ΔΔCt = ΔCt (実験群) - ΔCt (対照群)
RQ = 2^(-ΔΔCt)
光誘導がシロイヌナズナ AtSUC2 遺伝子の発現に及ぼす影響を調べる上記の実験を想定すると、qPCR の結果は次のようになります。
計算では、まずコントロール群の2^-△Ctデータの平均を計算します（上図に示すように、0.00116）。次に、2^-△Ctの各値をこの平均値で割って、2^-△△Ctの値を取得します。最後に、これらの値を整理して平均値と標準偏差を取得し、実験群の標的遺伝子の発現レベルがコントロール群と比較して約9.73倍増加していることを示します。
結果は、Graphpad ソフトウェアを使用して次のようにプロットされます。 
ソフトウェアの t 検定を使用して計算された P 値は 0.0024 で、0.05 未満であり、統計的に有意な差があり、結果が信頼できることを示しています。
結果分析 - 二重標準曲線法
実際のアプリケーションでは、ターゲット遺伝子と参照遺伝子の増幅効率が異なることが多いため、同じ増幅効率を達成するにはプライマーを再設計し、反応条件を最適化する必要があります。ただし、より便利な方法であるデュアルスタンダード曲線アプローチを選択することもできます。
ここでは、まず絶対定量の分析方法を理解しましょう。具体的な手順は、PCRでターゲットフラグメントを増幅し、次にターゲットフラグメントをクローニングベクターに挿入し、組み換えプラスミドを抽出し、シークエンシングで正しいことを確認した後、標準として使用できます。プラスミドDNAの量は、Nanodropなどの機器を使用して測定でき、コピー数はコピー数変換式を使用して特定のプラスミドコピー数に変換されます。その後、一連の希釈に従ってDNAを増幅します。標準コピー数の対数をx軸、測定されたCt値をy軸として標準曲線をプロットします。未知のサンプルのCt値に基づいて、その絶対コピー数を計算できます。
コピー数計算式:
コピー数 = (質量 ÷ 相対分子量) × 6.02 × 10^23
デュアルスタンダードカーブ法では、ターゲット遺伝子とリファレンス遺伝子の標準サンプルを別々に作成し、絶対定量を行い、標準曲線を作成します。未知のサンプルの絶対コピー数を計算した後、比較することで、より高い精度が得られます。
具体的な計算式は以下のとおりです。
Q = 標的遺伝子のコピー数 / 参照遺伝子のコピー数
RQ = Q (実験) / Q (コントロール)
上記の実験では、光誘導がシロイヌナズナ AtSUC2 遺伝子の発現に及ぼす影響を調べるために、AtSUC2 と GAPDH の両方の標準サンプルが作成され、次の標準曲線が作成されました。
検査対象サンプル内の標的遺伝子と内部参照遺伝子の Ct 値は次のとおりです。
計算では、まず、標的遺伝子と内部参照遺伝子の Ct 値を標準曲線の線形関係に代入して、実験群と対照群の両方における標的遺伝子と内部参照遺伝子の絶対コピー数を取得します。次に、式 Q = 標的遺伝子コピー数 / 参照遺伝子コピー数を使用して、標的遺伝子の発現レベルを正規化します。最後に、式 RQ = Q (実験) / Q (対照) に従って、RQ は 9.71 と計算され、実験群の標的遺伝子の発現レベルが対照群の 9.71 倍高いことを示します。
結果は、GraphPad ソフトウェアを使用して次のようにプロットされます。
ソフトウェアの t 検定を使用して計算された P 値は 0.0008 で、0.05 未満であり、統計的に有意な差があり、結果が信頼できることを示しています。
これで、今回の qPCR データ分析は終了です。次に、実験データの精度と信頼性を高めるために、コスト効率の高いさまざまな製品をお勧めします。ぜひお買い求めください。
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