成熟 miRNA の長さはわずか 20 nt 程度で、通常、フォワードプライマーは全長をカバーするか、余分な部分さえあり、リバースプライマーを配置する場所がありません。現在の市場の解決策は、逆転写中に逆転写の長さを増やすことです。一般的な方法には、テーリング法とステムループ法があります。

1. はじめに
2. 推奨製品
3. 関連製品一覧

1. はじめに

マイクロRNA（miRNA）は、約21〜23塩基の大きさの一本鎖の小さなRNAであり、ダイサー酵素処理後に約70〜90塩基のヘアピン構造を持つ一本鎖RNA前駆体から生成されます。 miRNAは主に標的遺伝子mRNAの3'末端非コード領域に特異的に結合し、転写後の標的遺伝子mRNAの翻訳プロセスを制御して、mRNAの翻訳を阻害し、mRNAの分解を促進し、タンパク質の発現を減少させます。 miRNAの役割は、個体発生、組織分化、細胞増殖、アポトーシスなど、さまざまな心血管疾患の発生と発達に関与しています。

図1. 生体内でのmiRNA合成の模式図

成熟 miRNA の長さはわずか 20 nt 程度で、通常、フォワードプライマーは全長をカバーするか、余分な部分さえあり、リバースプライマーを配置する場所がありません。現在の市場の解決策は、逆転写中に逆転写の長さを増やすことです。一般的な方法には、テーリング法とステムループ法があります。

図2. テーリング法によるmiRNA合成

図3. ステムループ法によるmiRNA合成

テーリング法では、ポリAポリメラーゼを使用して成熟miRNAにポリ(A)テールを追加し、ユニバーサル配列を持つオリゴdTを逆転写プライマーとして使用して、cDNAの最初の鎖に対応する延長されたmiRNAを合成します。ステムループ法では、ステムループ構造に折り畳まれたユニバーサル配列をプライマーとして使用して、延長されたmiRNAに対応するcDNAの最初の鎖を合成します。ステムループ構造は、その後の増幅プロセス中に適切な温度で開かれ、関連する増幅プライマーと組み合わせられます。

表1. テーリングとステムループの比較

2. 推奨製品

2.1 Yeasen miRNA テール反転定量的組み合わせ (11148ES&11171ES)

図4. 11148ES-Hifair™ miRNA 1st Strand cDNA合成キット

このキットは、miRNA 第一鎖 cDNA の逆転写にテーリング法を採用しています。製品に含まれる 2×Hifair™ miRNA RT バッファーには、miRNA テーリング反応と逆転写反応に必要な原材料とプライマーがすべて含まれており、慎重に最適化されています。これにより、miRNA 3' 末端のポリ (A) 修飾と逆転写プロセスが同時に効率的に実行されることが保証されます。

図5. 11171ES -Hieff™ miRNAユニバーサルqPCR SYBRマスターミックス

miRNA定量検出用に特別に開発された新世代のプレミックス蛍光定量PCR検出試薬で、特殊なROXパッシブリファレンスダイが含まれており、すべてのqPCR機器に適しており、異なる機器でROXの濃度を調整する必要がなく、準備反応でプライマーとテンプレートをシステムに追加するだけで増幅を実行できます。DNAポリメラーゼは化学的に修飾されたホットスタートポリメラーゼを採用し、特殊なバッファーシステムと連携して、反応の特異性と感度を高め、より広い範囲で正確に定量化できます。

2.2 製品性能

2.2.1 すべてのプラットフォームのqPCR機器と互換性がある

図6. 異なるqPCR機器での結果の互換性

293T細胞の全RNAをテンプレートとして、Hifair™ miRNA 1st Strand cDNA合成キット（カタログ番号11148ES）で逆転写を行いました。得られたcDNAを10倍に希釈し、Hieff™ miRNA Universal qPCR SYBR Master Mix（カタログ番号11171ES）を使用して、それぞれhsa-miR-let-7b-5p、hsa-miR-let-7c-5p、U6の内部参照遺伝子を検出しました。

2.2.2 最大10pgまでの高い検出率

図7.増幅プロット

図8.増幅プロット

合成hsa-miR-let-7e-5p(a)および293T細胞Total RNA(b)をテンプレートとして使用し、それぞれ60コピーから606コピー（6つの勾配）および10 pgから100 ng（5つの勾配）に希釈し、Hifair™ miRNA 1st Strand cDNA合成キット（カタログ番号11148ES）で逆転写し、得られたcDNAをHieff™ miRNA Universal qPCR SYBR Master Mix（カタログ番号11171ES）でhsa-miR-let-7e -5p遺伝子発現について検出しました。

2.2.3 高い特異性、同じファミリー内のmiRNA間の1塩基の違いを区別できる

図9. miRNA間の一塩基の違いを区別する

ヒト hsa-let-7 ファミリーには複数の miRNA があり、互いに異なる塩基はわずかか、または 1 塩基しか異なっていません。各 Let-7 アイソフォーム (hsa-miR-let-7a~Let-7i、has-miR-98) の合成 miRNA は、Hifair™ miRNA 1st Strand cDNA 合成キット (カタログ番号 11148ES) を使用して cDNA に逆転写され、Hieff™ miRNA Universal qPCR SYBR Master Mix (カタログ番号 11171ES) を使用してこれらの miRNA を異なるプライマーで個別に増幅し、式 2-ΔCT x 100% を使用して一致率を計算しました。結果は、密接に関連するサブタイプ ファミリー メンバーを効果的に区別できることを示しています。

2.2.4 優れた増幅効率

図10.増幅効率

図11.増幅効率

miR-let-7b-5p、miR-let-7c-5p、miR-let-7e-5p、miR-let-7f-5p 遺伝子は、ヒト 293T 細胞とマウス肝臓 Total RNA をテンプレートとして使用して増幅されました。結果は、類似製品と比較して、Hifair™ miRNA 1st Strand cDNA 合成キット (カタログ番号 11148ES) が、Hieff™ miRNA Universal qPCR SYBR Master Mix (カタログ番号 11171ES) の反応システムと優れたパフォーマンスで一致していることを示しました。

2.2.5 優れた安定性

図12. 37℃で7日間の製品安定性分析

図13. 50回の凍結融解サイクル後の結果の分析

図14. 異なる温度における定量反応システムの24時間にわたる安定した分析特性

293T細胞Total RNAをテンプレートとしてHifair™ miRNA 1st Strand cDNA合成キット（カタログ番号11148ES）で逆転写を行い、得られたcDNAを10倍希釈してHieff™ miRNA Universal qPCR SYBRマスターミックス（カタログ番号11171ES）で検出しました。hsa-miR-let-7b-5p、hsa-miR-let-7c-5p、hsa-miR-let-7e-5pの発現。△Ct<0.5。

2.3 Yeasen miRNAステムループ反転定量的組み合わせ（11139ES＆11170ES）

図15. 11139ES-Hifair™ III 1st Strand cDNA合成キット（gDNAダイジェスタープラス）

このキットは、Hifair™ III 逆転写酵素をベースに開発されました。酵素 cDNA 合成速度が速く、熱安定性が大幅に向上しています。同時に、酵素はテンプレートとの親和性を高め、少量のテンプレートや低コピー遺伝子の逆転写に適しています。Hifair™ III 逆転写酵素の完全長 cDNA 合成能力も向上し、最大 19.8 kb の cDNA 合成が可能になりました。

図16. 11170ES-Hieff™ miRNAユニバーサルqPCR SYBRマスターミックス

本製品は、SYBR Green I キメラ蛍光法を用いた miRNA 定量化のための特別なマスターミックスです。miRNA 配列は短く、同じファミリー内の miRNA 配列は類似性が高いことが多いため、定量化の際には特異性が極めて求められます。本製品はホットスタート DNA ポリメラーゼをベースとし、最適化されたバッファーを備えているため、非特異的増幅を大幅に低減できます。また、特別な ROX リファレンス ダイにより、マスターミックスはすべての qPCR 機器に適合し、異なる機器で ROX を調整する必要がありません。反応システムを準備する際にプライマーとテンプレートを追加することで増幅を行うことができます。

2.3.1 すべてのプラットフォームのqPCR機器と互換性がある

図17. 異なるqPCR機器での結果の互換性

マウス肝細胞の全RNAをテンプレートとして、Hifair™ III 1st Strandで逆転写を行った。
cDNA合成キット（gDNAダイジェスタープラス）（カタログ番号11139ES）を使用し、得られたcDNAを40倍希釈してHieff™ miRNAユニバーサルqPCR SYBRマスターミックス（カタログ番号11170ES）を使用して、それぞれヒトmmu-miR-125a遺伝子を増幅しました。

2.3.2 高感度、最大10pg

図18. 感度検出

マウス肝細胞の全RNAをテンプレートとして、Hifair™ III 1st Strand cDNA合成キット（gDNAダイジェスタープラス）（カタログ番号11139ES）で逆転写を行い、得られたcDNAを10倍段階希釈（範囲10pg/μL、-0.1μg/μL）し、マウス由来のmmu-miR-125a、mmu-miR-132、およびmmu-miR-351遺伝子を増幅しました。

2.3.3 高い特異性、同じファミリー内のmiRNA間の1塩基の違いを区別できる

図19. miRNA間の単一塩基の違いを区別する

ヒト hsa-let-7 ファミリーには複数の miRNA があり、互いに異なる塩基はほとんどないか、または 1 塩基しか異なっていません。これらの miRNA は、Hieff™ miRNA Universal qPCR SYBR Master Mix (Cat# 11170ES) を使用して、異なるプライマーで個別に増幅され、一致率は 2^-Δct x 100% の式を使用して計算されました。

2.3.4 優れた再現性

図20. 再現性の検出

ヒト293T細胞の全RNAを逆転写のテンプレートとして使用し、Hifair™ III 1st Strand cDNA合成キット（gDNAダイジェスタープラス）（カタログ番号11139ES）で逆転写を行い、得られたcDNAを50倍希釈し、Hieff™ miRNAユニバーサルqPCR SYBRマスターミックス（カタログ番号11170ES）を使用して、90ウェル複製実験でヒトhsa-let-7a遺伝子を増幅しました。

2.3.5 優れた安定性

図21. 11170ESの14日間の異なる温度での安定性分析

図22. 11170ESの繰り返し凍結融解の解析

図23. 異なる温度での24時間にわたる定量反応システムの安定した分析特性

マウス肝細胞の全RNAをテンプレートとして使用し、Hifair™ III 1st Strand cDNA合成キット（gDNAダイジェスタープラス）（カタログ番号11139ES）で逆転写を行いました。得られたcDNAを100倍に希釈し、マウスmmu-miR-132遺伝子を増幅しました。

3. 関連製品一覧

イェーセンバイオテクノロジー（上海）有限公司は2014年に設立され、ツール酵素原料と抗原抗体の研究開発と生産に従事するハイテク企業です。その製品には、医薬品、食品安全検査、育種、司法などの業界で使用される分子診断酵素、タンパク質、抗体が含まれます。私たちは、生命科学分野の顧客に高品質の製品とサービスを提供することに尽力しています。イェーセンが提供する関連製品は次のとおりです。

表2. 関連製品リスト