ダイレクトPCRとは、核酸抽出や核酸精製の工程を経ずに、血液、動物や植物の組織などを直接増幅に利用する反応です。DNA増幅にこれまでにない利便性をもたらし、多くの時間を節約できます。では、ダイレクトPCRで使用される試薬や製品は何でしょうか？

1. ダイレクトPCRとは
2. ダイレクトPCRに必要な試薬
3. ダイレクトPCRキットの応用シナリオと特徴
4. 製品データ
5. クライアントからのフィードバック
6. 製品注文情報

1. ダイレクトPCRとは

世界中の無数の学者による継続的な補充と改良を経て、PCR技術は生命科学分野全体で最も広く使用され、最も頻繁に使用され、最も重要な基礎研究方法になりました。伝統的なPCR技術の幅広い応用に基づいて開発されたタッチダウンPCR、RT-PCR、リアルタイムPCR、マルチPCRなど、最新のデジタルPCR（デジタルPCR）は、大多数の科学研究者の研究を大幅に豊かにしました。これらの方法は、現代の生命科学、特に分子生物学の発展を大幅に加速し、人類全体の生命と自然の研究に大きく貢献しました。伝統的なPCR技術とそこから派生したさまざまな新技術と新しいアプリケーションには、前提条件があります。つまり、高純度の核酸テンプレートを事前に入手する必要があります。どのような生物学的サンプルでも、PCRの技術的要件を満たす核酸サンプルを取得するには、一連の複雑で面倒なサンプル処理を経る必要があります。DNAとRNAの分離と抽出は、関連する科学技術者が毎日繰り返す必要がある基本的な作業でした。サンプル間の大きな違いにより、DNAとRNAの分離抽出プロセスも大きく異なります。この作業では、オペレーターに高いレベルの技術熟練度が求められます。従来の分離抽出技術では、毒性の非常に高い化学試薬を使用しているため、長期間の暴露はオペレーターの体に不可逆的な損傷を引き起こし、実験中に直接損傷を与えることさえあります。フェノールやクロロホルムなどの化学試薬は実験室の重要な発がん物質であり、植物組織の核酸分離抽出プロセスで使用される液体窒素は、その超低温により、実験中のオペレーターの安全に大きな脅威をもたらします。同時に、研究するサンプルが大量にある人にとって、核酸の分離と抽出は労働集約的な作業です。現在、市場に出回っている核酸分離抽出キットは成熟しており、多くのブランドがありますが、それらはすべてほぼ同じです。シリカ膜カラム遠心キットであれ、磁気ビーズ法キットであれ、多くの時間がかかり、コストも高くなります。キットのコストに加えて、実験室設備には特別な要件があります。磁気ビーズ法で使用される自動化ワークステーションは、非常に典型的な大規模で高価な設備であり、実験室にとって大きな費用がかかります。まとめると、PCR実験を行う前に、サンプルの前処理は研究者にとって避けられない、そして常に頭を悩ませる問題です。この問題を解決し、核酸の分離と抽出なしでPCR実験を直接実行する方法は、多くの科学研究者と臨床検査担当者が常に考えてきた問題でした。

ダイレクトPCRは、核酸を抽出せずに動物や植物の組織を直接増幅する反応です。多くの点で、ダイレクトPCRは従来のPCRと同じように機能します。主な違いは、ダイレクトPCRで使用されるカスタムバッファーです。サンプルは核酸を抽出せずに直接PCR反応にかけることができますが、ダイレクトPCR反応に関与する酵素の耐性とバッファーの適合性には対応する要件があります。一般的なサンプルにはPCR阻害物質が多かれ少なかれ含まれていますが、ダイレクトPCRは酵素とバッファーの作用下で信頼性の高い増幅を実現できます。ただし、従来のPCR反応では、反応のテンプレートとして高品質の核酸を使用する必要があります。テンプレートにタンパク質やその他の不純物が含まれていると、PCR反応のスムーズな進行が妨げられます。

ダイレクトPCRの最も古い応用分野は、マウス、ネコ、ニワトリ、ウサギ、ヒツジ、ウシなどの動物の血液、組織、毛、植物の葉や種子などの動植物の分野です。遺伝子型判定、トランスジェニック、プラスミド検出、遺伝子ノックアウト解析、DNA源同定、種の同定、SNP解析などの研究に使用されています。これらの分野には共通の特徴があり、標的遺伝子の含有量が比較的高く、核酸抽出が面倒です。そのため、ダイレクトPCRは時間を節約し、結果への影響が少ないだけでなく、コストも節約できます。

2. ダイレクトPCRに必要な試薬

2.1 サンプル溶解液

サンプル溶解液は自分で準備することも、購入することもできます。溶解液のブランドによって成分が異なるため、溶解能力が異なり、溶解時間も若干異なります。たとえば、動物組織サンプルを準備する場合、一般的には 30 分または一晩溶解することが推奨され、ウイルスの溶解液の場合は 3 ～ 10 分です。

2.2 PCRマスターミックス

特異的増幅とより強力な増幅能力を高めるには、ホットスタート DNA ポリメラーゼの使用をお勧めします。ダイレクト PCR の核となるのは、耐性の高いポリメラーゼです。

2.3 DNA増幅に影響を与えるサンプル中の成分を除去または阻害する

サンプルが溶解液で処理された後、タンパク質、脂質、その他の細胞破片が放出され、これらの物質がPCR反応を阻害します。したがって、直接PCRでは、これらの要因の影響を減らすために、対応する除去剤または阻害剤を追加する必要があります。

3. ダイレクトPCRキットの応用シナリオと特徴

Yeasen のダイレクト PCR キットは、植物、動物組織、血液、その他の元のサンプルを核酸精製なしで直接増幅できるため、PCR 実験プロセスが大幅に簡素化されます。PCR ベースのジェノタイピング (図 1) は、ゲノム精製なしの元のサンプル (図 1A) またはその溶解物 (図 1B) をテンプレートとして使用して実行されました。一般的な PCR ベースのジェノタイピングと比較して、ダイレクト PCR キットはサンプル消費量が少なく、操作が簡単で、実験コストが低く、高品質の定量サンプル検出が可能です。

図 1. 直接 PCR 技術。

A. 直接法: 少数のサンプルを採取し、PCR 識別のために PCR ミックスに直接追加します。B. 溶解法: サンプルを溶解溶液に追加してゲノムを放出し、少量の溶解上清を PCR 識別のために PCR ミックスに追加します。

3.1 アプリケーション

動物遺伝子増幅検出、トランスジェニック動物の遺伝子型判定、トランスジェニック植物の識別、植物の遺伝子型判定など。

3.2 特徴

★ 直接：DNA精製なし。
★ 高速：テンプレートの準備に 10 分、PCR 反応の完了に 50 分。
★ シンプル: サンプルをせん断したり粉砕したりせずに溶解できます。
PCRミックスはマスターミックスの形態をとっており、サンプルの追加手順が削減されます。
★ 節約：材料消費量の削減
★ハイスループット：溶解反応は96ウェルプレートで完了できます
★ 強力な阻害剤耐性

4. 製品データ

4.1 多動物ユニバーサルタイプ：動物組織ダイレクトPCRキット

4.1.1 最速：操作時間を短縮

図 2. Yeasen の動物組織直接 PCR キットを使用すると、さらに時間を節約できます。

4.1.2 例: ノックアウトマウスの遺伝子型同定

図3. 遺伝子ノックアウト動物の検出のための動物組織の直接増幅ダイレクトPCRキットの結果。

M: 100bp DNA ラダー。レーン 1 ～ 8: テンプレートとして溶解液を使用。+: テンプレートとして 50 ng の精製ゲノム DNA。﹣: テンプレートとして脱イオン水。複数サイクル: 35 サイクル。単一フラグメント (580bp): ノックアウト動物ホモ接合ゲノム。単一フラグメント (180bp): 野生型ゲノム。2 つのフラグメント (580bp/180bp): ノックアウト動物ヘテロ接合ゲノム。

4.2 げっ歯類特異性：マウス組織直接PCRキット

4.2.1 より速く：十分な遺伝子放出

図4 異なる溶解時間によるマウス組織直接PCRキットの直接増幅結果。

M: 100bp DNA ラダー。+: テンプレートとして 50 ng の精製ゲノム DNA。複数サイクル: 35 サイクル。

4.2.2 一般的なアルカリ溶解法よりも優れている

図 5. 異なる溶解方法で処理したマウスの尾の SOX21 遺伝子増幅結果。

M: 100 bp DNA ラダー。レーン 1-2: 一般的なアルカリ溶解によるテンプレートとしての溶解物。レーン 3-4: マウス組織直接 PCR キットによるテンプレートとしての溶解物。+: テンプレートとしての 50 ng の精製ゲノム DNA。-: テンプレートとしての脱イオン水。複数のサイクル: 35 サイクル。

4.2.3 類似製品と比較する

図 6. 異なるブランドの類似製品で処理したマウスの尾の SOX21 遺伝子増幅結果。

M: 100 bp DNA ラダー。+: テンプレートとして 50 ng の精製ゲノム DNA。複数サイクル: 35 サイクル。

4.3 植物組織直接PCRキット

4.3.1 多種植物サンプルの検証

図 7. さまざまな植物の葉を直接増幅した結果。

M: 100 bp DNA ラダー。C: テンプレートとしての精製ゲノム DNA。レーン 1 ～ 2: テンプレートとしての葉組織ライセート。複数サイクル: 30 サイクル。

5. クライアントからのフィードバック

5.1 マウスの遺伝子型解析

図 8. 北京 Jishi Life Technology Co., Ltd. のユーザーがマウス組織直接 PCR キットを使用してマウスの遺伝子型を識別した結果。

5.2 ライスダイレクトPCR

図 9. 華中農業大学のユーザーによる植物組織直接 PCR キットを使用したイネ関連遺伝子の増幅。

6. 製品注文情報

Yeasenは、分子、タンパク質、細胞という3大生物学的試薬の研究、開発、生産、販売を行っているバイオテクノロジー企業です。Yeasenが提供する製品は以下の通りです。

表1. 製品注文情報