よくある問題

考えられる理由

解決

陽性コントロールおよびテスト対象のサンプルにはバンドはありませんでした。

PCR反応システムまたは反応条件が適切ではありませんでした。

グラジエント PCR を使用して、PCR に最適な反応条件を探ります。

PCR 試薬を不適切に保管すると活性が失われます。

2× マウス ダイレクト PCR ミックスは -20°C で保存し、使用中に凍結と解凍を繰り返さないようにしてください。頻繁に使用する場合は、短期間であれば 4°C で保存できます。

プライマー設計の問題。

プライマーを再設計して確認してください。

陽性コントロールには対象のバンドがあり、テスト対象のサンプルにはバンドがないか、または弱いバンドがあります。

不適切な保管や長期保管は試薬の活性を低下させる可能性があります。

新しい試薬を使用してください。

組織溶解液を過剰に加えます。

反応システムを増やすか、溶解液の量を減らしてください。

サンプル溶解混合物が不適切に保管されていたか、保管期間が長すぎたため、DNA ゲノムが劣化しています。

溶解液混合物は 4°C で 2 ～ 3 日間保存できます。PCR には、新しく調製した溶解液混合物を使用するようにしてください。

追加されたテンプレートの量が適切ではありません。

添加するテンプレートの量は、反応系の1〜10％の範囲内で最適化されました。

PCRサイクル数が不十分です。

PCR サイクル数を増やします。35 ～ 40 サイクルが理想的です。テンプレートの複雑さのため、PCR 反応は精製 DNA テンプレートの場合よりも 5 ～ 10 サイクル多く実行する必要があります。

非特異的増幅

PCR アニーリング温度が低すぎる、サイクル数、プライマー濃度、またはテンプレート濃度が高すぎる。

PCR アニーリング温度を上げ、PCR サイクル数、プライマー濃度、またはテンプレート濃度を下げます。

PCRプライマーの不一致。

PCRプライマーを再設計します。

PCR 反応系を準備する際の温度が高すぎるか、準備が完了してからの時間が長すぎます。

PCR反応系の準備は低温で行い、準備完了後できるだけ早くPCR増幅反応を行う。

ネガティブコントロールにターゲットバンドが現れる

操作ツールまたは試薬の汚染。

実験で使用する試薬や機器はすべてオートクレーブ処理する必要があります。ターゲット配列がサンプルガンに吸い込まれたり、遠心管からこぼれたりしないように、取り扱いには十分注意してください。

サンプル間の相互汚染。

各サンプラーは 1 つのサンプルのみに使用します。または、1 つのサンプルを採取した後、サンプラーの端を 2% 次亜塩素酸ナトリウム溶液に浸し、繰り返しすすいだ後、きれいなペーパータオルで残留物を乾かします。