Yeasen とMolefutureバイオテクノロジーによる画期的な成果
バイオテクノロジーの急速な発展に伴い、mRNA療法は、その強力なプログラミング性と応答速度の速さから、新たな治療法として大きな注目を集めています。mRNAワクチンや遺伝子治療などの分野では、高品質のmRNAを効率的に合成することが、治療目標を達成するための重要なステップです。このプロセスでは、T7 RNAポリメラーゼが重要な役割を果たします。T7 RNAポリメラーゼは、mRNAのin vitro合成を効率的に触媒できるためです。
T7 RNAポリメラーゼのdsRNA副産物問題
T7 RNAポリメラーゼはmRNA合成において重要な役割を果たしますが、実際の操作では、副産物として二本鎖RNA（dsRNA）が生成されることがよくあります。dsRNAが存在すると、mRNAの収量と純度が低下するだけでなく、非特異的免疫反応を引き起こし、有効性と安全性に影響を与える可能性があります。そのため、dsRNAの生成を減らすことは、業界で緊急のニーズとなっています。現在、dsRNAを減らす方法は、主に反応条件の最適化と補助酵素の使用です。これらの方法は、ある程度dsRNAの生成を減らすことができますが、操作が複雑でコストが増加するなどの問題を伴うことがよくあります。
なぜ T7 RNA ポリメラーゼ エンジニアリングを行う必要があるのでしょうか?
T7 RNA ポリメラーゼを直接改変して dsRNA の生成を減らすことは、より根本的な解決策です。酵素指向進化技術は、酵素のアミノ酸配列または構造を正確に変更することで、その触媒特性を改善し、製品の純度と収量を高めることができます。T7 RNA ポリメラーゼの場合、標的を絞った改変により、dsRNA の生成を減らすだけでなく、mRNA 合成の全体的な効率と品質を高めることもできます。
mRNA の in vitro 合成原料のサプライヤーである
dsRNAはどのように生成されるのでしょうか?
文献報告によると、副産物 dsRNA の生成は主に 2 つの原因から生じます (図 1)。1 つ目は、転写の初期段階で T7 RNA ポリメラーゼが開始構造から伸長構造に遷移する間に、転写三元複合体が解離しやすくなり [1]、長さ約 20 nt の多数の短い RNA 鎖 (不完全 RNA) がシステムに放出されることです。これらの RNA 鎖は「プライマー」として機能し、長い RNA 鎖と相補的に対になり、T7 RNA ポリメラーゼの RNA 依存性 RNA ポリメラーゼ活性 (RDRP 活性) の作用下で伸長して dsRNA を生成します [2,3]。2 つ目の原因は、T7 RNA ポリメラーゼが持つ末端リボヌクレオチド転送活性によって引き起こされます。転写反応が線状テンプレートの末端に達すると、T7 RNA ポリメラーゼはテンプレートに依存せずにランダムにいくつかのリボヌクレオチドを追加することがあります。これらのリボヌクレオチドは「ランダムプライマー」を形成し、逆折り畳まれて標的mRNA領域と相補的に対になり、伸長してdsRNAを生成します。ループによって生成されたdsRNAはループバックdsRNAと呼ばれます[3,4]。したがって、dsRNA副産物を減らすために、T7 RNAポリメラーゼの改変の焦点は、初期転写三元複合体を安定化するか、T7 RNAポリメラーゼの末端転移活性とRNA依存性RNAポリメラーゼ（RDRP）活性を弱めることです。
図1. エネルギー障壁とdsRNA形成原理の模式図（未発表データ）
T7 RNAポリメラーゼの構造遷移のエネルギー障壁を克服するにはどうすればよいでしょうか?
研究チームは、構造および自由エネルギー分析を通じて、T7 RNAポリメラーゼの構造変化とともにエネルギーも変化することを発見しました。伸長構造の自由エネルギーは開始構造の自由エネルギーよりも大幅に高く、転写プロセスが完全なmRNA鎖を生成するにはより高いエネルギー障壁を克服する必要があることを示しています。高いエネルギー障壁はスムーズな構造遷移には不利です。そのため、研究チームは合理的なスクリーニング方法を利用して20を超えるホットスポットアミノ酸を特定し、対応する飽和変異ライブラリを構築しました。
T7 RNAポリメラーゼの末端転移とRDRP活性を変更する方法
一方、T7 RNAポリメラーゼの末端転移活性とRDRP活性に関連する機能、部位、構造ドメインに関する報告が限られていること、また機能的に類似しているこれら2つの活性がT7 RNAポリメラーゼの主要反応である転写活性（すなわちDNA依存性RNA重合活性、DDRP）と重要な部位を共有している可能性が高いことを考慮すると、部位特異的修飾のためのホットスポットアミノ酸を見つけることは困難です。そのため、研究チームはエラープローンPCRに基づく複数のランダム変異ライブラリを同時に構築し、ZymeEditorプラットフォームのハイスループット進化能力と組み合わせて、個々のライブラリごとに10^6を超える多様性を実現しました。
プローブに基づく理想的なT7 RNAポリメラーゼの発見
T7 RNAポリメラーゼの生産のバランスを取り、in vitro転写反応におけるdsRNAの含有量を監視するために、研究チームは最適化された転写テンプレートを参考に、標的mRNA産物の異なる領域を標的とする複数の蛍光プローブを慎重に設計しました。これらのプローブは、反応収量、完全性、システム内のdsRNA含有量などの情報を蛍光信号と関連付けます。システムの蛍光強度が強いほど、変異体の性能は有利になります。理論的には、このスクリーニング方法は、異なるプローブの蛍光強度に基づいて変異体をランク付けし、収量が高い、またはAbortive RNAが減少するT7 RNAポリメラーゼ変異体、および完全性が向上した、またはループバックdsRNAが減少した変異体を得ることができます。反応テンプレートをRNAに置き換えると、RDRP活性が低下した変異体もネガティブスクリーニングされ、T7 RNAポリメラーゼのテンプレート選択性が向上します。さらに、修飾ヌクレオチド、キャップ類似体を添加し、液滴反応システム内の反応温度を上げることで、非天然基質を許容し、改善された熱安定性を示す T7 RNA ポリメラーゼ変異体を選択するためのさらなるスクリーニングを実施できます。
最適なT7 RNA ポリメラーゼをスクリーニングするにはどうすればよいでしょうか?
研究チームは、ライブラリーのサイズに基づいて、蛍光活性化液滴選別法（FADS）に基づく超ハイスループットスクリーニングプロセスと、従来のマイクロプレート法（MTPS）に基づくハイスループットスクリーニングプロセスを開発しました。複数回の実験を通じて、合計10^7を超える変異体がスクリーニングされ、dsRNA含有量が大幅に減少した複数の変異体が得られました。その中で、一部の変異体は、反応中のAbortive RNAによって引き起こされるdsRNAの減少を示しており、これらのポリメラーゼ変異体の伸長構造がより安定していることを示唆しています。一部の変異体は、反応中のループバックdsRNA含有量の減少を示しており、これらの変異体の末端転移活性またはRDRP活性が弱まっていることを示しています。
前述の変異体のパフォーマンス上の利点は異なるメカニズムに由来することから、研究チームはそれらをターゲットとしたDNAシャッフルライブラリを構築しました。スクリーニングの結果、研究チームは最終的に、収量とmRNAの完全性に影響を与えずにdsRNA生成が極めて低い、優れたパフォーマンスの変異体を得ました（図2）。しかし、Modernaによって発見された変異体G47A + 884Gの収量は影響を受けました[5] （未発表）。
図2. 酵素の進化プロセスと変異体の性能の特徴
（未発表）
T7 RNAポリメラーゼ変異体によるdsRNA生成の分析?
図3に示すように、9kbの転写テンプレートを共転写キャッピング条件下で定量分析した結果、野生型T7 RNAポリメラーゼは天然ヌクレオチドを使用した場合に約2.9ng/μgのdsRNAを生成しましたが、市販のT7酵素は約0.18ng/μgのdsRNAを生成しました。しかし、構築された各T7 RNAポリメラーゼ変異体のdsRNA生成は0.10ng/μg未満でした。特に、1つの変異体はわずか0.015ng/μgで、野生型の約200倍、市販製品の12倍低い値でした。繰り返しテストを行った結果、さまざまな反応条件下で一貫して変異体のdsRNA削減における性能上の利点が見られ、これらの変異体のシステム互換性が良好であることを示しており、反応バッファーの最適化を通じてdsRNA生成をさらに削減するための基礎が築かれています。さらに、FADSスクリーニングにより、製品の完全性と熱安定性が向上した複数の変異体が得られ、より広範囲のin vitro転写アプリケーションの要件を満たすことができます。
図 3.
現在、いくつかのパートナーがすでに T7 RNA ポリメラーゼ変異体を試用しており、高い評価を得ています。新しい酵素の使用により、mRNA 精製プロセスが簡素化され、作業効率が向上し、さまざまなアプリケーション シナリオで優れたパフォーマンスを発揮します。
これらのバリアントは特許申請中であり、技術協力やライセンスに関する話し合いを歓迎します。
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二本鎖RNA (dsRNA) ELISAキットの検証レポートを共有し、dsRNA検出の標準化を推進します。
参考文献:
[1] Sousa R、Mukherjee S. T7 RNAポリメラーゼ[J]。核酸研究と分子生物学の進歩、2003：1-41。
[3] Vallejo D, Nikoomanzar A, Paegel BM, et al. 単一細胞指向進化のための蛍光活性化液滴選別[J]. ACS合成生物学、2019、8(6):1430-1440。