二本鎖RNA (dsRNA) ELISAキットの検証レポートを共有し、dsRNA検出の標準化を推進します。

mRNA の in vitro 転写中に残留 dsRNA を検出する信頼性の高い方法をお探しですか? 二本鎖 RNA (dsRNA) ELISA キットが最適です。ただし、市販のキットがいくつかあるため、検証データが必ずしも公開されているとは限らず、dsRNA 検出に一貫性がない可能性があることに注意することが重要です。そのため、特異性、精度、正確性、感度、耐久性を網羅した二本鎖 RNA (dsRNA) ELISA キットの検証レポートを公開しています。このレポートは、特定の実験条件と規制薬局方基準に合わせて調整された dsRNA 残留検出方法を検証するためのリファレンス ガイドとして役立ちます。dsRNA 検出の標準化を促進するために、当社の検証レポートの詳細をご覧ください。

二本鎖RNA（dsRNA） ELISAキット

背景：

二本鎖 RNA (dsRNA) ELISA キットは、mRNA の in vitro 転写プロセス中に生成される残留 dsRNA を検出するために設計された試薬キットです。このキットは、二重抗体サンドイッチ酵素結合免疫吸着測定 (ELISA) の実験原理とビオチン-ストレプトアビジン増幅システムを採用しており、サンプル内の残留 dsRNA を高感度に検出します。

概要データには、特異性、精度、正確性、感度、耐久性をカバーする検証パラメータが含まれています。このレポートは参照ガイドとして機能し、ユーザーが特定の実験条件に合わせて調整し、規制薬局方基準に準拠した dsRNA 残留検出方法を検証するよう促します。

材料と方法：

キット: 二本鎖 RNA (dsRNA) ELISA キット: Cat#36717ES (YEASEN) 。このキットには、4 つの異なるタイプの dsRNA 標準サンプルが含まれています。ユーザーは、標準曲線を生成するための特定のプロセスに一致する標準サンプル タイプを選択できるため、すべてのサンプルを準備してテストする必要がなくなります。

方法: 実験に不可欠な材料と手順は、主に Yeasen Biotechnology によって指定されています。キットは広範囲にわたるテストと評価を受けており、その性能が ICH Q2(R1) および 2020 年版中国薬局方第 4 部「9101 分析法検証ガイドライン」の規定要件を満たしていることが保証されています。

結果

  1. dsRNA標準の直線性

このレポートでは、それぞれ 300bp の長さを持つ 4 つの異なるタイプの dsRNA 標準すべてについて標準曲線を作成しました。これらの標準には、STD1 (未修飾 dsRNA)、STD2 (擬似 UTP 修飾 dsRNA)、STD3 (N1-Me-擬似 UTP 修飾 dsRNA)、および STD4 (5-OMe-UTP 修飾 dsRNA) が含まれます。各タイプの dsRNA 標準は、R2 > 0.99 の優れた希釈直線性と、測定濃度の変動係数 (CV) が 10% 未満であることを表 1 から表 5 に示します。

 

性病名

UTPタイプ

希釈の直線性（R 2 ＞ 0.99）

履歴書

STD1

UTPA の

0.0156-1 pg/μL

＜ 10%

STD2

翻訳

0.0156-1 pg/μL

＜ 10%

STD3

N1-Me-pUTP

0.0312-1 pg/μL

＜ 10%

STD4

5-オメガ-UTP

0.0625-1 pg/μL

＜ 10%

表 1. さまざまな dsRNA 標準の直線性。

 

STD1濃度（ pg / μL ）

測定値（ pg/μL ）

回復

履歴書

1

1.0001

100.0%

3.1%

0.5

0.4994

99.9%

2.4%

0.25

0.2516

100.7%

3.3%

0.125

0.1227

98.1%

0.5%

0.0625

0.0640

102.5%

3.2%

0.0312

0.0309

99.2%

1.3%

0.0156

0.0157

100.4%

3.2%

0

/

/

/

表2. 希釈したSTD1の回収率とCV

 

STD2濃度（ pg / μL ）

測定値（ pg/μL ）

回復

履歴書

1

1.0001

100.0%

0.7%

0.5

0.4994

99.9%

0.1%

0.25

0.2514

100.6%

0.9%

0.125

0.1232

98.6%

2.5%

0.0625

0.0635

101.6%

1.1%

0.0312

0.0312

99.9%

0.5%

0.0156

0.0155

99.6%

0.0%

0

/

/

/

表3. 希釈したSTD2の回収率とCV

 

STD3濃度（ pg/μL ）

測定値（ pg/μL ）

回復

履歴書

2

2.0031

100.2%

1.6%

1

0.9880

98.8%

2.4%

0.5

0.5188

103.8%

1.2%

0.25

0.2383

95.3%

2.2%

0.125

0.1242

99.4%

0.1%

0.0625

0.0629

100.7%

1.8%

0.0312

0.0361

115.7%

1.6%

0

/

/

/

表4. 希釈したSTD3の回収率とCV

 

STD4濃度（ pg/μL ）

測定値（ pg/μL ）

回復

履歴書

4

4.0096

100.2%

1.9%

2

1.9940

99.7%

0.7%

1

0.9977

99.8%

0.1%

0.5

0.5108

102.2%

0.1%

0.25

0.2454

98.2%

5.6%

0.125

0.1207

96.5%

2.8%

0.0625

0.0624

99.9%

0.3%

0

/

/

/

表5. 希釈したSTD4の回収率とCV

 

  1. 特異性

  • dsRNA、ssRNA、dsDNA、ssDNA による特異性分析。
図 1. このキットは dsRNA のみを識別し、ssRNA、dsDNA、ssDNA は検出しません。

  • 特異性はdsRNAの長さによって影響を受けませんでした。
図 2. キットの特異性は、異なる長さ (160 bp および 500 bp) の dsRNA 間で一貫しています。

  1. 正確さ

dsRNA 含有量が 0.36 pg/μL の既知の mRNA サンプルに 0.5 pg/μL の STD1 を 3 つの異なる容量比 (1:1、1:20、1:250) で添加しました。すべてのケースで、スパイク回収率は 80 ～ 120% の範囲内でした。

スパイク回収率は次のように計算されます: スパイク回収率=(スパイク後の測定濃度×スパイクサンプルの総量-サンプルの測定濃度×サンプルの総量)/(スパイクの理論濃度×スパイクの容量)×100%

サンプル

STD1/サンプルの体積比

測定されたdsRNA（pg/μL）

スパイク回復率

サンプル（TS）

/

0.36

/

TS+0.5pg/μL STD1

1：1

0.769

81%

TS+0.5pg/μL STD1

1：20

0.777

82%

TS+0.5pg/μL STD1

1：250

0.803

82%

表6. スパイク回収率分析

  1. 精度

  • アッセイ内精度

4 つの dsRNA 標準サンプルそれぞれについて、3 つの濃度レベル (高、中、低) で実験が行われました。1 回の実験で、各濃度サンプルは 8 回繰り返しテストを受けました。結果は、変動係数 (CV) が 15% 未満であり、良好なアッセイ内精度を示しています。

STD1

理論濃度（pg/μL）

複製する

測定平均値（pg/μL）

履歴書

1

8

1.0002

3.11%

0.125

8

0.1230

0.46%

0.0156

8

0.0164

3.18%

STD2

理論濃度（pg/μL）

複製する

測定平均値（pg/μL）

履歴書

1

8

1.0001

0.65%

0.125

8

0.1231

2.46%

0.0156

8

0.0162

0.02%

STD3

理論濃度（pg/μL）

複製する

測定平均値（pg/μL）

履歴書

2

8

2.0022

1.58%

0.25

8

0.2444

2.17%

0.0312

8

0.0328

1.64%

STD4

理論濃度（pg/μL）

複製する

測定平均値（pg/μL）

履歴書

8

8

8.0803

0.27%

1

8

0.9650

0.12%

0.125

8

0.1322

2.76%

表7. アッセイ内精度分析

  • アッセイ間の精度

3 つのバッチのキットを使用して 3 つの実験を実施しました。各実験では、高、中、低の濃度が選択され、4 つの dsRNA 標準サンプルごとに 3 回、8 回反復してテストされました。その結果、各濃度レベルで 24 のデータ ポイントが取得され、変動係数 (CV) 分析に使用されました。結果は、標準の各濃度の CV が 15% 未満であることを示しています。

STD1

理論濃度（pg/μL）

独立したテスト/複製

測定平均値（pg/μL）

履歴書

1

3/8

1.0007

2.38%

0.125

3/8

0.1186

3.20%

0.0156

3/8

0.0173

1.27%

STD2

理論濃度（pg/μL）

独立したテスト/複製

測定平均値（pg/μL）

履歴書

1

3/8

0.9987

0.09%

0.125

3/8

0.1269

1.06%

0.0156

3/8

0.0151

0.52%

STD3

理論濃度（pg/μL）

独立したテスト/複製

測定平均値（pg/μL）

履歴書

2

3/8

2.0012

2.37%

0.25

3/8

0.2415

0.14%

0.0312

3/8

0.0330

1.81%

STD4

理論濃度（pg/μL）

独立したテスト/複製

測定平均値（pg/μL）

履歴書

8

3/8

7.9735

1.89%

1

3/8

1.0225

0.13%

0.125

3/8

0.1227

5.63%

表8. 試験間精度分析

 

  1. 感度

  • LODF

キットの検出限界は、ブランク値の平均に標準偏差の 2 倍を加算して決定されます。24 個のブランクの OD を測定し、その平均値と標準偏差を計算し、これらの値を近似曲線に適用すると、対応する検出限界が得られます。

外径

dsRNA 標準

ブランクの平均

空白のSD

ブランクの平均+2SD

LODF

STD1

0.016

0.00048

0.01696

≤0.001pg/μL

STD2

0.016

0.00072

0.01744

≤0.001pg/μL

STD3

0.034

0.00119

0.03638

≤0.001pg/μL

STD4

0.115

0.00290

0.1208

≤0.01pg/μL

表9. LOD分析

  • LOQ

キットの定量限界は、標準曲線の最低濃度点をさらに低いレベルに希釈し、最低濃度で CV < 20% を確保することで定量閾値を定義することによって確立されます。LOQ は次のとおりです。

dsRNA 標準

LOQ

複製する

CV(%)

回復 （％）

STD1

0.0156pg/μL

24

＜10%

80〜120%

STD2

0.0312 pg/μL

24

＜10%

80〜120%

STD3

0.0156pg/μL

24

＜10%

80〜120%

STD4

0.125pg/μL

24

＜10%

80〜120%

表10. LOQ分析

  1. 耐久性

  • IVT材料への干渉防止

このテストは、mRNA サンプルに添加されたさまざまな酵素、バッファーなどがキットによる dsRNA 検出に与える影響を評価することを目的としています。

提供された mRNA サンプルに、特定の濃度の T7 RNA ポリメラーゼ、RNase 阻害剤、IPPA (無機ピロホスファターゼ)、DNase I、VCE (ワクシニアキャッピング酵素)、2'-O-メチルトランスフェラーゼ (MT)、1×IVT バッファー、および 1mM クエン酸ナトリウムを加え、その後、標準曲線の作成とサンプルのテストの両方に STD3 を使用することで、これらのサンプル中の dsRNA 含有量を検出するキットの能力を評価できました。結果は、8 つの異なる酵素とバッファーの存在が dsRNA の正確な検出に影響を与えなかったことを示しています。さらに、観察された回収率は 80% ～ 120% の範囲内でした。

IVTマテリアル

dsRNA測定値（pg/μL）

回復

なし

0.6057

100%

T7 RNAポリメラーゼ（15μg/mL）

0.5411

89.32%

マウスRNase阻害剤（27.5μg/mL）

0.5142

84.88%

無機ピロホスファターゼ（IPPA 10μg/mL）

0.7132

117.7%

DNase I (13.75μg/mL)

0.6077

100.32%

ワクシニアキャッピング酵素（10μg/mL）

0.6563

108.3%

2´-O-メチルトランスフェラーゼ（10μg/mL）

0.5776

95.4%

1×IVTバッファ

0.5003

82.6%

1mMクエン酸ナトリウム

0.6251

103.2%

表11. IVT物質を添加した希釈STD3の回収率

  • 温度耐久性

キットは 4°C と 37°C の両方で保管され、7 日後に dsRNA 標準の濃度変動が検出されました。結果は、変動がすべて 20% 以内であることを示しています。

dsRNA 標準

dsRNA測定値 (pg/μL) 0日目

4℃で7日間経過後の変動

STD1

1

10%

STD2

1

5%

STD3

2

7%

STD4

4

11%

dsRNA 標準

dsRNA測定値（pg/μL）

37℃で7日間経過後の変動

STD1

1

18%

STD2

1

4%

STD3

2

5%

STD4

4

8%

表12. 温度耐久性分析


      関連商品:

      製品名 製品コード 仕様
      二本鎖RNA（dsRNA）ELISAキット 36717ES 48T/96T
      CleaScrip™ T7 RNAポリメラーゼ（低dsRNA、250 U/μL） 10628ES 10/100 KU
      T7 RNAポリメラーゼGMPグレード（250 U/μL) 10625ES 10/100 KU

      関連記事:

      二本鎖 RNA (dsRNA) ELISA キットは、J2 抗体ドットブロッティング法と組み合わせて、低 dsRNA T7 RNA ポリメラーゼ変異体を検証するために使用されました。

      低dsRNA T7 RNAポリメラーゼ変異体、mRNAワクチンおよび治療法の開発を促進


      参考文献:

      1. ICH、2022：分析法バリデーションQ2、ドラフト版。
      2. NMPA、2007：生物学的製品の品質管理分析のための分析方法の検証の評価に関する一般原則
      3. 中国薬局方委員会（ChPC）、2020年：中国薬局方、第4部：生物サンプルの定量分析方法の検証に関するガイドライン

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