近年、mRNA ベースの医薬品が大きな注目を集め、研究の焦点となっています。T7 RNAP は、そのシンプルさと、in vitro で高収率かつ忠実に RNA 合成を触媒する能力で知られています。しかし、転写プロセス中に、T7 RNAP は不完全短鎖 RNA、未成熟 RNA、3' 伸長 RNA などの副産物を生成する可能性があり、これが dsRNA の形成に好ましい条件を作り出します。そのため、実用化においては、dsRNA の生成を減らすことが急務となっています。
最近、
FADS ベースの T7 RNAP スクリーニング
T7 RNAPのスクリーニングには、タンパク質進化のハイスループット要件を満たすためにFADS（蛍光活性化液滴選別）が選択されました。細胞の早期断片化を防ぐために、研究者は二重水相を備えたPDMSチップを使用し、リゾチームをチップ上の細胞と混合し、液滴内でその活性を発揮しました（図1） 。研究者は、10 5から10 6の範囲の多様性を持ついくつかのランダム変異体ライブラリを生成しました。スクリーニング後、10の優勢な変異体が特定され、Mut1からMut10と命名されました。図2Eと図2Fに示すように、Mut1、Mut7、およびMut9のdsRNA含有量は、野生型のdsRNA含有量よりも大幅に低かったです。
図1. FADSの概要
図2. ランダムライブラリスクリーニングと変異体評価
T7 RNAPの半合理的設計
研究者らは半合理的設計探索を実施し、10 個の単一部位飽和ライブラリを作成し、スクリーニングには従来のマイクロタイタープレートベースのデュアルプローブ法を採用しました (図 3 )。追加された 5' 末端プローブは、RNA 収量の検出に使用されます。
図3. 減少したdsRNAの構造誘導半合理的設計
1000以上の変異体をスクリーニングした後、研究者らは6つの候補を特定しました：Mut11（K180E）、Mut12（S228F）、Mut13（G238L）、Mut14（A70Q）、Mut15（A383H）、およびMut16（I743L）。6つの変異体の総RNA収量は野生型と有意に異ならず、全体的な転写効率が同等であることを示しています。予想通り、Mut11とMut14のdsRNA含有量は野生型と比較して有意に低かったです（図4 ）。
図4. マイクロタイタープレートスクリーニングと変異体評価
DNAシャッフルによるMut17はdsRNAの生成量を減らす
T7 RNAPをさらに最適化するために、dsRNA含有量が低く、生産要件を満たす4つのバリアントが選択されました。研究者らは次にDNAシャッフルライブラリを構築し、マイクロタイタープレートでスクリーニングして、親T7 RNAPと比較してdsRNA生産が低いバリアントを特定し、Mut17（A70Q / F162S / K180E）と名付けました。その後、Mut17とその親バリアント（Mut14、Mut11、およびMut7）の転写産物を分析しました。図5に示すように、4つのバリアントはすべて、野生型と比較して転写中にdsRNA生産が大幅に減少しました。注目すべきことに、Mut17はスクリーニングの溶媒システムでわずか1.80％と大幅に低いdsRNA含有量を示し、0.007 ng /μgまで低下しました。
図5. Mut17とその親変異体のdsRNA含有量
変異体からの IVT 産物の免疫原性は、野生型のものよりも大幅に低くなります。
次に、マウスRAW264.7細胞におけるIVT産物の免疫原性を評価しました。図2Aおよび2Bに示すように、変異体によって生成されたmRNAを導入したRAW264.7細胞では、野生型と比較してIFN-β mRNAおよびタンパク質レベルが低下しており、野生型T7 RNAPによって合成されたmRNAが最も強い免疫応答を引き起こし、変異体からのmRNAは応答が大幅に低下したことを示しています。具体的には、Mut11 RNAで処理した細胞のIFN-β mRNAは野生型で処理した細胞のわずか9.7％であり、そのタンパク質は12.93 pg/mLでした。さらに、EGFPの発現は、異なるT7 RNAPによって生成されたmRNA間で量的または質的な有意差を示さず（図6C） 、産業用途の要件を満たしていました。
図6. 哺乳類細胞におけるIFN-β応答とEGFP発現
変異体の RDRP および末端転移酵素活性は野生型のものよりもはるかに低い。
dsRNA の減少に対する突然変異の影響を調べるために、研究者らはこれらすべての突然変異についてコンピューターによる研究を実施しました。結果は、これらの変異体では RNA をテンプレートとして利用する傾向が低下していることから、RDRP 活性が低下していることを明確に示唆しています。同様に、これは T7 RNAP の末端転移酵素活性に影響を与えた可能性があります。図7に示すように、異なる濃度では、4 つの変異体すべてが野生型と比較して蛍光値の 50% 未満を示しました。
続いて、3'末端不均一性アッセイを用いて、T7 RNAPの末端転移活性を特徴付けた。末端転移酵素活性を反映するn>0のRNAの割合に注目すると、研究者らは、これらのRNAが野生型では82.94%を占めるのに対し、変異体では次の割合を示していることを発見した：Mut11（70.29%）、Mut7（67.88%）、Mut14（63.31%）、およびMut17（55.62%） （図8 ） 。重要なことに、これらの割合は、生成物中のdsRNAの存在量と非常に一致している（図5） 。これらの結果は、変異体の末端転移酵素活性の大幅な低下を示しており、これがRDRP活性の低下とともにdsRNAの減少に寄与している。具体的には、末端転移酵素活性がより重要な役割を果たしている可能性があり、これはMut17で観察されるn>0 RNAの蓄積が最も低く、dsRNAの産生も最も低いことからも明らかです（図5および図8 ） 。
図7相対的なRDRP活性
図8 RNA産物の3'末端の不均一性
結論
この研究は、dsRNA 含有量が減少した変異体を特定するための堅牢な方法論を提供し、RNA 依存性 RNA ポリメラーゼとターミナルトランスフェラーゼの活性が減少した複数の dsRNA 変異体を分離することに成功しました。この研究は、mRNA 治療に不可欠な安全性と有効性の検証を大幅に強化し、mRNA ワクチンと遺伝子治療の応用の発展に重要な意味を持つことを強調しています。
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