オルガノイド培養の総合ガイド

— オルガノイドについての理解を深めるための総合的な記事。

オルガノイドの紹介

オルガノイドは、体外での 3D 培養によって得られる、内臓や組織の正常な (または病気の) 状態を模倣した生理学的機能を備えた 3 次元構造です。簡単に言えば、オルガノイドは、幹細胞をマトリックス ゲルで培養する 3 次元細胞培養です。化学阻害剤/活性剤、サイトカイン、培養添加物の影響を受けて、オルガノイドは対応する臓器に似た組織構造に成長します。

オルガノイドの特徴

オルガノイドは自己複製能力を持ち、元の組織の生理学的構造と機能を維持します。オルガノイドは「皿の中の微小臓器」と呼ばれることもあります。オルガノイドは幹細胞の自己複製、分化、自己組織化能力を利用して、バイオバンクで使用するために凍結保存することができ、無制限に増殖することができます。オルガノイドは非常に複雑で、2D 細胞と比較すると、生体内の状態に非常に似ています。

図1. ヒト大腸腺癌細胞のオルガノイド培養 [1]

オルガノイドの応用

オルガノイドの特徴は、生体内環境をより良くシミュレートできることで、分子生物学および細胞生物学の分析に適しています。動物レベルと細胞レベルのギャップを埋めるオルガノイドは、腫瘍研究、薬物スクリーニング、再生医療などの分野での研究に優れたソリューションを提供します。オルガノイドは、機能的組織誘導、疾患モデルの確立、薬物スクリーニング、抗炎症試験、臨床研究、およびその他のさまざまな研究面で広く応用されており、基礎研究とトランスレーショナルアプリケーションの両方で大きな可能性を示しています。

オルガノイド培養システムと実験技術が進化するにつれ、腸（小腸/結腸）、胃、肝臓、心臓、肺、前立腺、膵臓、腎臓、乳房、脳のような構造、網膜、内耳など、さまざまな組織や臓器にオルガノイドが使用されるようになりました。

腫瘍幹細胞から得られるオルガノイドは、腫瘍の発生と発達のメカニズムの理解、薬剤感受性のスクリーニング、精密医療と個別診断の促進に大きな可能性を示しています。Cell と Science の複数の記事では、オルガノイドが抗がん剤の効果を予測する上で高い感度と特異性を示すことが示されています。最近、腫瘍オルガノイドは、抗がん剤に対する患者の反応を予測し、個別治療計画の策定を支援する役割を果たすことが実証されています。

発達メカニズムの研究：オルガノイドの分化能力は、胚発生のプロセスとメカニズムの研究に適しています。WntやBMPなどのシグナル伝達経路によって制御される誘導プロセスは、脳、膵臓、胃などの臓器の発達を研究するために使用できます[2][3][4]。

疾患傷害モデルの確立：特定の組織または臓器から誘導されたオルガノイドは、特定の疾患モデルの研究に使用できます。Zhao BingとLin Xinhuaが率いるチームは、ヒトオルガノイド感染モデルを使用してSARS-CoV-2感染と肝臓障害の分子メカニズムを研究し、ウイルスの発症メカニズムとその後の薬剤開発の研究に重要なツールを提供しました[5]。北京大学生命科学学院のDeng Hongkuiが率いる研究グループは、小分子とサイトカインを使用して、損傷再生機能を備えた新しい腸オルガノイド、Hyper Organoidの構築を促進しました。このオルガノイドは、長期間にわたって継代および増幅することができ、ゲノムを維持し、結腸組織の損傷の修復を促進し、急性大腸炎動物モデルの病理学的症状を緩和するなどの効果があります[6]。

再生医療：幹細胞由来オルガノイドは、損傷または病変組織を修復または置換して、正常な組織機能を回復することができます。これらは、他の神経変性疾患、糖尿病、心血管疾患、網膜障害、脊髄損傷など、細胞療法において広範囲に応用されています。再生医療の分野における新しい治療法として、DA01 は、SB-431542、LDN193189、CHIR-99021、Y-27632、ソニック ヘッジホッグ (Shh) タンパク質などの小分子を使用して、多能性幹細胞を刺激し、ドーパミン作動性ニューロンに分化させます。これらのニューロンは、その後、末期パーキンソン病患者の脳の損傷部位に移植され、この病気の治療に新たな方向性とアプローチを提供します [7]。

薬物毒性および有効性試験：オルガノイドは、特定の臓器や組織における新薬の薬理毒性を検証するために使用でき、新薬開発のためのデータサポートを提供します。ハイマン腎臓オルガノイドを使用してシスプラチンの腎毒性を検証した例がその一例です[8]。

薬物スクリーニング：幹細胞由来のオルガノイドは薬物反応のin vitro試験に使用でき、薬物スクリーニングの理論的裏付けとなる。結腸オルガノイドはCFTR変異を持つ患者の投薬計画の研究に使用でき、腫瘍オルガノイドは患者の個別投薬状況の評価に使用できる[9]。

オルガノイドの発達史

オルガノイドの供給源

通常のオルガノイドは主に、多能性幹細胞 (PSC) や成体幹細胞 (ASC) などの幹細胞から生じます。多能性幹細胞には、胚性幹細胞 (ESC) や人工多能性幹細胞 (iPSC) が含まれます。多能性幹細胞と比較すると、成体幹細胞はモデル化が簡単で高速であるという利点がありますが、構築されるオルガノイド構造が比較的単純であるという欠点があります。多能性幹細胞から構築されるオルガノイド構造はより複雑です。

オルガノイド培養に使用される製品

オルガノイド培養でよく使用される小分子（概要）：非常に実用的なので、ブックマークするのを忘れないでください。

❶ Y-27632 (Cat#53006ES、Cat#52604ES): Rock の強力な阻害剤で、ATP 競合により p160ROCK (Ki=140 nM) および ROCK-II (IC50=800 nM) を競合的に阻害します。また、PRK2 (IC50=600 nM) も阻害します。通常、プレート培養での最初の播種時に添加します。その後の培地交換では添加が不要な場合があります。ヒト胚性幹細胞を Y-27632 (10 µM) で 1 時間処理すると、アポトーシスが阻害され、クローン効率が向上し、細胞の継代が延長されます。

推奨作業濃度: 10 μM

❷ SB-202190（カタログ番号53005ES）：p38α/βを標的とする効率的なp38 MAPKキナーゼ阻害剤。SB202190は、ヒト胚性幹細胞の心筋細胞への分化を誘導し、神経幹細胞の自己複製を促進し、胃腸および乳腺オルガノイドの培養に適用できます。

推奨溶解濃度: 10 mg を 3.018 mL の DMSO に溶解して 10 mM 溶液を得、-20℃ で保存します。

推奨作業濃度: 10 μM

❸ CHIR-99021（カタログ番号53003ES）：アミノピリミジン誘導体で、GSK-3（GSK3α/β）阻害剤として作用します。ヒト胚性幹細胞の内胚葉への分化を誘導し、腎臓および網膜オルガノイド培養に使用されます。CHIR-99021は、他の試薬と組み合わせて使用​​すると、体細胞の幹細胞への再プログラミングを刺激します。

推奨溶解濃度: 5 mgを3.58 mLのDMSOに溶解して3 mM溶液を得、-20℃で保存します。

推奨作業濃度: 3 μM

❹ A 83-01（カタログ番号53002ES）：アクチビン/NODAL/TGF-β経路阻害剤。ALK5/4/7キナーゼ活性を阻害します。肝臓、前立腺、乳腺オルガノイドの培養に一般的に使用されます。人工多能性幹細胞（iPSC）の分化を阻害し、in vitroでの細胞の自己複製を維持するためによく使用されます。

推奨溶解濃度: 5 mg を 5.93 mL の DMSO に溶解して 2 mM 溶液を得、-20℃ で保存します。(注意: この製品は溶液中で不安定なため、調製後すぐに使用することをお勧めします。)

推奨作業濃度: 2 μM

❺ ガストリン I (カタログ番号 53007ES): ガストリンは、胃壁細胞を刺激して胃酸を分泌させる内因性胃腸ペプチドホルモンです。胃腸オルガノイドの研究には不可欠です。腸および肝臓オルガノイドを培養する際にガストリンを添加すると、オルガノイドの生存期間が延長されます。

推奨溶解濃度: 1 mg を 2.38 mL の 1% アンモニア溶液に溶解して 0.2 mM 溶液を得、-20℃ で保存します。

推奨作業濃度: 10 nM

❻ ニコチンアミド（カタログ番号 51402ES）：ビタミン B3 であるニコチンアミドは、さまざまな酵素酸化還元反応に関与し、胃腸、肝臓、乳腺オルガノイドの培養に使用されます。ニコチンアミドは、サイトカインやその他の生化学試薬と組み合わせて、抗炎症特性を示し、間葉系幹細胞のインスリン産生細胞への分化を促進し、サーチュイン活性を阻害し、オルガノイドの形成を促進し、オルガノイドの寿命を延ばすために使用されます。

推奨溶解濃度: 100 mg を 8.19 mL の H2O (または DMSO) に溶解して 100 mM 溶液を得、-20℃ で保存します。

推奨作業濃度: 10 mM

❼ フォルスコリン（カタログ番号 51001ES）：フォルスコリンは、細胞内 cAMP レベルを上昇させるために一般的に使用されるアデニル酸シクラーゼを活性化することができます。フォルスコリンは、さまざまな細胞タイプの分化を誘導し、PXR と FXR を活性化し、抗血小板凝集および抗高血圧効果があります。肝臓オルガノイドを培養する場合、この物質を添加することが不可欠です。

推奨作業濃度: 1-10 μM

❽ プロスタグランジン E2 (カタログ番号 60810ES): プロスタグランジン E2 (PGE2) は多くの生理学的システムを調節し、細胞の増殖と分化を媒介します。肝臓および前立腺オルガノイドを培養する際に必要であり、平滑筋の弛緩、炎症、生殖、睡眠周期の調節、および胃粘膜の完全性と関連しています。

推奨溶解濃度: 1 mg を 0.28 mL の DMSO に溶解して 10 mM 溶液を得、-20℃ で保存します。

推奨作業濃度: 500 nM

❾ N-アセチル-L-システイン（カタログ番号50303ES）：N-アセチル-L-システイン（NAC）は抗酸化物質グルタチオンの前駆体であり、抗酸化作用とROS阻害作用があります。神経細胞のアポトーシスを阻害し、ほとんどのオルガノイドの培養プロセスに必要です。

推奨溶解濃度: 2 g を 24.51 mL の H2O (または DMSO) に溶解して 500 mM 溶液を得、-20℃ で保存します。

推奨作業濃度: 1 mM

関連製品情報

参考文献：

[1] Sato T, Stange DE, et al. ヒト結腸、腺腫、腺癌、バレット上皮からの上皮オルガノイドの長期増殖。消化器病学。2011年11月;141(5):1762-72。doi: 10.1053/j.gastro.2011.07.050。Epub 2011年9月2日。PMID: 21889923。

[2] Lancaster MA, Renner M, et al. 大脳オルガノイドはヒトの脳の発達と小頭症をモデル化する。Nature. 2013.501(7467):373-379. http://dx.doi.org/10.1038/nature12517.

[3] Greggio C, et al. 人工3次元ニッチがin vitroで膵臓の発達を解明する。Development. 2013.140(21):4452-4462. http://dx.doi.org/10.1242/dev.096628.

[4] McCracken KW, et al. 多能性幹細胞由来の胃オルガノイドを用いたヒトの発達と疾患のモデル化。Nature. 2014.516(7531):400-404. http://dx.doi.org/10.1038/nature13863.

[5] Zhao B, Ni C, et al. ヒト肝管オルガノイドを用いたSARS-CoV-2感染および胆管細胞障害の再現。Protein Cell. 2020年10月;11(10):771-775. doi: 10.1007/s13238-020-00718-6. PMID: 32303993; PMCID: PMC7164704.

[6] Qu M、Xiong L、et al。損傷関連上皮再生をモデル化した腸管オルガノイド培養の確立。Cell Res。2021年3月;31(3):259-271。doi：10.1038/s41422-020-00453-x。Epub 2021年1月8日。PMID：33420425; PMCID：PMC8027647。

[7] ブルーロック・セラピューティクス社、進行性パーキンソン病患者を対象とした第1相試験でDA01を投与された最初の患者を発表。ブルーロック・セラピューティクス社プレスリリース：2021年6月8日。

[8] Takasato M, Er PX, et al. ヒトiPS細胞由来の腎臓オルガノイドは複数の系統を含み、ヒトの腎形成をモデル化する。Nature. 2015.526(7574):564-568. http://dx.doi.org/10.1038/nature15695.

[9] Spence JR、Mayhew CN、et al. ヒト多能性幹細胞のin vitro腸組織への誘導分化。Nature. 2011.470(7332):105-109. http://dx.doi.org/10.1038/nature09691.