オルガノイド研究Q&A: 知っておくべきことすべて

オルガノイドに関する研究が深まるにつれ、参加する人も増えています。この記事では、オルガノイドに関する一般的な知識[1-5]をまとめ、皆様のお役に立てれば幸いです。

Q: オルガノイドは単一の種類の細胞で構成されていますか、それとも多細胞組織で構成されていますか?

オルガノイドは、成体幹細胞または多能性幹細胞を体外で 3 次元 (3D) 培養することで形成され、特定の空間構成を持つ組織のような構造になります。オルガノイドは単一細胞で構成された構造ではなく、幹細胞の特性を持つ開始細胞の分裂と分化を誘導することで形成され、その後、生体内の対応する臓器に類似した特定の空間構造、形態、機能を持つ組織に自己組織化します。

 

Q: オルガノイドを培養するための原料は何ですか?

（1）多能性幹細胞由来のオルガノイドには、成体幹細胞（ASC）、多能性幹細胞（PSC）、人工多能性幹細胞（iPSC）が含まれます。（2）組織抽出細胞由来のオルガノイドは、腫瘍組織によく見られます。

 

Q: 新鮮な組織がない場合でも、凍結組織を 3D 培養に使用できますか?

はい、しかし凍結組織のサイズに対する要件が高く、一次凍結組織および細胞の生存率が大幅に低下し、その後の培養の成功率が大幅に低下します。

 

Q: オルガノイドはどのように凍結され、蘇生されるのですか?

オルガノイドを凍結する最適な時期は、オルガノイドの活性と分化能が最高になる継代数 2 ～ 5 のときです。オルガノイドの蘇生は、細胞蘇生に使用される方法に従って行うことができます。

 

Q: 培養オルガノイドのサイズを制御する必要はありますか? また、大きすぎると有利になりますか?

はい、オルガノイドには内部血管や気液循環系がないため、サイズを制御する必要があります。500μm以内が望ましいです。オルガノイドのサイズが大きいと、中心近くの細胞が外部環境と酸素や栄養素を交換するのに苦労します。そのため、構造が大きくなるほど、死細胞の数が増えます。

 

Q: マトリックスゲル以外に、オルガノイドの培養に何が使えますか?

マトリックスゲルに加えて、オルガノイドを培養するための代替手段には、（1）脱細胞外マトリックスおよびその他の誘導タンパク質、（2）合成ハイドロゲル、および（3）設計された組換えタンパク質ゲルが含まれます。

 

Q: オルガノイドの指向的分化はどのように達成できるのでしょうか?

オルガノイドにおける幹細胞誘導分化の初期発達は、複数のシグナル伝達経路によって共同で制御されます。in vitro 培養では、これらのシグナル伝達経路の活動をシミュレートし、細胞を特定の方向に分化するように誘導するために、成長因子を追加する必要があります。たとえば、Y27632 とアクチビン A による誘導により、胚性幹細胞 (ESC) または人工多能性幹細胞 (iPSC) を胚様体 (EB) に分化させることができます。その後、シグナル伝達経路は Wnt3a、FGF-4、Noggin などの因子によって制御され、幹細胞の特定の方向への分化を誘導します。

Q: 臨床サンプルを採取する際に汚染を避けるにはどうすればよいですか?

（1）できる限り無菌サンプリングを確実に行う。 （2）抽出前に、抗生物質を含むPBSに数分間浸漬する。胃、腸、膀胱など外部環境と接触する可能性のある領域にある腫瘍の場合は、3％〜5％の抗生物質を含むPBSに5〜10分間浸漬することが推奨される。その他の一般的な腫瘍の場合は、1％〜2％の抗生物質を含むPBSに約5分間浸漬する。 （3）細胞抽出中に使用するすべての試薬には、1％の抗生物質と適切な濃度の一次抗生物質が含まれている必要があります。

 

Q: 腫瘍組織の採取、保存、輸送にはどのような予防措置が必要ですか?

腫瘍細胞を多く含む腫瘍組織を可能な限り採取し、組織サンプルの空気への露出時間を最短にすることで汚染の可能性を減らします。採取した腫瘍組織サンプルは、できるだけ早く専用のサンプル保存液を入れた滅菌チューブに入れ、低温（4℃程度）で迅速に検査ユニットに輸送します（採取後2～4時間以内に配送するよう努めます）。

 

Q: 病変から培養されたオルガノイドと隣接組織から培養されたオルガノイドには違いがありますか?

腫瘍組織の採取部位の要件は何ですか? はい、違いがあります。腫瘍自体は不均一性を示すため、異なるソースから採取したオルガノイド間で違いが見られるのはよくあることです。形態学的には、原発性病変から採取したオルガノイドは、隣接組織から採取したものに比べて侵襲性の高い構造になる傾向があり、一般的に不規則に見えます。モデリングや薬物スクリーニングのエラーを最小限に抑えるには、活動が良好な領域から複数のサンプルを採取する必要があります。

 

Q: 腫瘍オルガノイドの薬剤感受性試験にはどのような種類の薬剤を使用できますか?

臨床現場における抗腫瘍薬の主な種類は、細胞傷害性薬剤（パクリタキセル、シスプラチン/カルボプラチン、5-FUなど）、標的薬剤（EGFR、HER2、VEGFRなどを標的とする薬剤）、免疫チェックポイント阻害剤（PD-1抗体、PD-L1抗体など）に代表される免疫療法薬の3つに分類できます。

 

Q: PDO栽培の成功率はどのくらいですか?

PDO 培養の成功率は、供給源によって若干異なります。ほとんどの PDO の成功率は 63% ～ 70% ですが、最大 90% に達することもあります。これは、組織自体の活性と大きく相関しています。さらに、臨床治療が成功率に影響を与えることもあります。組織の体外培養と手術のステップの時間を短縮することで、成功率を向上させることができます。

 

Q: 凍結組織はオルガノイドの培養に使用できますか?

一般的に、組織の凍結保存は生存率の大幅な低下を招くため推奨されません。ただし、組織を -80°C で保存する場合、オルガノイド培養に最適な期間は保存後 6 週間以内です。組織を液体窒素で保存する場合、保存期間はより長くなりますが、6 か月を超えないことが望ましいです。

Q: 初代培養細胞を抽出すると、線維芽細胞が混ざってしまうことがあります。どのように対処すればよいでしょうか？

（１）線維芽細胞は接着性が低いため、繰り返し接着することで除去される可能性がある。（２）線維芽細胞除去試薬は使用できるが、オルガノイド培養に影響を与えるかどうかは実験的検証が必要である。

 

Q: 腫瘍オルガノイドを培養するには、元の腫瘍組織がどれくらい必要ですか? 生検サンプルで十分ですか?

一般的に、手術組織は大豆 2 ～ 3 個分の大きさよりも大きくなければなりません。針生検で採取する場合は少なくとも 2 ～ 3 個のサンプルが必要であり、内視鏡生検の場合は少なくとも 6 個以上の腫瘍組織をクランプする必要があります。

 

Q: 腫瘍組織のサンプルが小さすぎて、培養されたオルガノイドの数がその後の検査に不十分な場合は、どうすればよいですか?

腫瘍由来のオルガノイドは継代後に表現型の違いが現れる可能性があるため、一般的に継代は推奨されません。文献では、オルガノイドの継代を 2 ～ 3 世代、最大 5 世代に制限することが推奨されています。細胞数が少なすぎて 5 世代後にテスト要件を満たせない場合は、より小さな 384 ウェル プレートを使用するか、テストにマイクロ流体チップを使用するなど、テスト方法の変更を検討してください。

 

Q: 腫瘍組織内に正常細胞は存在しますか? これらの正常細胞をどうやって除去するのでしょうか?

正常細胞が少数存在する可能性があります。まず、採取中に正常組織をサンプリングしないようにしてください。次に、一次細胞を抽出した後、磁気ビーズ選別またはフローサイトメトリーを使用して、さらにオルガノイドを培養することができます。正常細胞がごく少数存在する場合、その後のオルガノイドのモデリングと培養に大きな影響を与えないため、除去する必要がない場合があります。

 

Q: 腫瘍組織から原発細胞を抽出すると、細胞が赤く見えるのはなぜですか?

生体内の組織は血液供給に富んでいるため、赤血球が多く存在します。ほとんどの場合、処理は必要なく、オルガノイド培養に影響はありません。赤血球が多すぎる場合は、培養前に溶解バッファーで適切に処理することができます。

 

Q: オルガノイドの培養中に黒い粒子が見つかりました。どうすれば除去できますか?

黒い粒子は不純物または細胞の破片である可能性が高いです。これらは 2 つの方法で除去できます。

オルガノイドを消化し、培地で繰り返し洗浄して不純物を希釈します。

滅菌外科用メスを使用してオルガノイドを半分に切断し、培地を満たした 1 ml の注射器を使用してオルガノイドから不純物をゆっくりと洗い流します。

 

Q: オルガノイド培養の継代数に制限はありますか? また、何回まで継代できますか?

継代数は、一般的にソース細胞の特性によって異なります。ほとんどのオルガノイドは、in vitro で最大 10 回 (6 か月以上) 継代できます。培養条件の選択もある程度影響する可能性がありますが、馴化培地は一般に合成因子培地よりも優れています。

 

Q: 腫瘍細胞株 (HepG2 細胞株など) を PDO に培養できますか?

PDO は複雑な自己組織化構造です。単一の細胞株によって形成された 3D 培養システムは PDO と呼ぶことはできません。単に 3D 球状状態と呼ばれます。

 

Q: オルガノイドを継代するための基準は何ですか?

オルガノイドの発達状態に応じて時間は異なりますが、通常は 5 ～ 10 日で、直径は約 100 ～ 200 μm です。ゆっくりと発達するオルガノイドの中には、適切な継代状態に達するまでに数週間かかるものもあります。

 

Q: 生存可能なオルガノイドの数を数えるにはどうすればいいですか?

実験中、事前に調製したカルセイン-AM 保存溶液を取り出し、カルセイン-AM 溶液を培地に加えて最終濃度を 0.2μmol/L にします。37°C で 60 分間インキュベートします。時間が経過したら、カルセイン-AM を含む培地を PBS でゆっくりと洗い流し、新しい培地を追加します。励起波長 490 nm、発光波長 515 nm の蛍光顕微鏡を使用して、オルガノイドを観察し、写真を撮ります。生きたオルガノイドは緑色で、縁がはっきりしています。直径が 20μm を超えるオルガノイドを数えます。

 

Q: オルガノイドの生存率を計算するにはどうすればいいですか?

オルガノイドの生存率は、次の式に従って計算されます: X=(Nlive/Ntotal)×100%。ここで、X はオルガノイドの生存率を表します。Nlive は生存オルガノイドの数を表します。Ntotal はオルガノイドの総数を表します。

 

Q: オルガノイドを識別する方法は何ですか?

最も基本的な方法は、顕微鏡でオルガノイドの形態を観察し、H&E 染色を行うことです。その他の方法としては、ウエスタンブロット、qRT-PCR、免疫蛍光、フローサイトメトリーなどがあり、オルガノイドが対応するバイオマーカーを発現しているかどうかを検出します。遺伝子配列決定により、培養されたオルガノイドとソース組織間の遺伝子の一致を特定できます。一部のオルガノイドについては、特定の機能を備えているかどうかを確認するための機能テストを実施できます。たとえば、研究では、胃オルガノイドは胃酸を分泌でき、心臓オルガノイドは自律的に拍動できることが示されています。

 

Q: 正常細胞もオルガノイドに成長できますか? 腫瘍オルガノイドの培養中に正常オルガノイドを除去するにはどうすればいいですか?

正常細胞もオルガノイドに成長します。正常オルガノイドを除去する方法には、(1) 顕微鏡下での HE 染色結果に基づく手動選択、(2) 培養培地の組成を調整して PDO を精製する (成長因子/小分子阻害剤など)、(3) フローサイトメトリーまたは磁気ビーズ選別用に PDO を単一細胞に分散させる、などがあります。

 

Q: 薬剤感受性実験中、PDO をマトリックスゲルから消化する必要がありますか?

いいえ、PDO は生体内条件をシミュレートするために 3 次元構造が必要です。マトリックス ゲルのサポートがないと、薬剤感受性実験の精度に影響します。通常、可溶性薬剤はマトリックス ゲルを透過してオルガノイドに作用しますが、免疫細胞化学実験を行う場合は、マトリックス ゲルを除去する必要があります。

 

Q: PDO 実験は動物モデル (PDX) を完全に置き換えることができますか?

PDO は PDX を部分的に置き換えることはできますが、完全に置き換えることはできません。

 

Q: 栽培中に PDO が異常に成長し、以前の状態と比較して成長サイクルが短縮され、急速に増殖する理由は何でしょうか?

外的要因： （1）この異常は、線維芽細胞などの特定の汚染細胞の大規模な増殖によって引き起こされる可能性があります。このような場合は、切片染色と観察を行ってこれらの汚染細胞の存在を確認し、除去を進めることをお勧めします。（2）特定の因子または小分子の添加を含む培養条件の変化は、PDOの増殖経路をさらに活性化する可能性があります。

内部要因:遺伝子変異の可能性。これを確認するには、配列決定が推奨され、その結果を主要な PDO の結果と比較して、遺伝子変異があるかどうかを判断する必要があります。

 

Q: PDO の薬剤に対する感受性はどのようにテストできますか?

PDO の薬剤感受性は、CCK8 アッセイ、ATP 細胞生存率アッセイ、生細胞/死細胞染色などの方法を使用してテストできます。腫瘍オルガノイドの ATP 活性を評価するのが最も一般的な方法です。ATP は細胞内で最も重要なエネルギー分子であり、細胞の代謝レベルを測定するために使用でき、生存細胞の数を反映します。薬剤投与が細胞 ATP 含有量に与える影響に基づいて、分析ソフトウェアを使用して各薬剤レジメンの IC50 値 (テストされた薬剤の最大阻害濃度の半分) を計算し、腫瘍阻害に最も効果的な薬剤を選択できます。

 

Q: PDO の薬剤感受性実験の濃度範囲は、原発性腫瘍細胞の濃度範囲と同じですか?

いいえ、同じではありません。通常、PDO の薬物濃度は初代細胞よりも高くする必要があります。正式な薬物感受性実験に最適な濃度を分析するために、予備実験を実施することができます。

 

Q: 薬物試験には成長のどの段階でオルガノイドを使用すべきですか?

一般的に、薬物試験には 5 継代以内のオルガノイドを使用することが推奨されます。この段階で、オルガノイドは最高の安定性と活性を示します。

 

Q: オルガノイドの確立の成功を判断する基準は何ですか?

（1）初期の予備評価：オルガノイドの形態は、細胞状態から液胞状、出芽状、緻密状、または緩い状態などの形態に変化します。 （2）特定のバイオマーカー発現の特定。これは組織切片の分布と類似しているはずです。さらに詳細な比較を行うために、シーケンス分析をさらに実行できます。

 

Q: オルガノイド培養は通常の細胞培養とどう違うのでしょうか?

（1）異なる細胞培養方法：オルガノイドは、その3次元構造を維持するために基質または空間構造のサポートを必要とするが、通常の細胞培養ではこれを必要としない。 （2）オルガノイド培養では、体外分化と自己組織化を達成する必要があり、そのため誘導のためにさまざまなサイトカインの組み合わせを使用する必要があり、その結果、比較的複雑な培養培地成分が生じる。通常の細胞培養では通常、1種類の細胞のみが使用されるため、培養培地成分は比較的単純である。 （3）異なる細胞源：オルガノイドは多能性上皮細胞に由来するが、通常の細胞培養は、さまざまな種類の選択された細胞を培養するのに適している。

 

Q: 培養した 3D 球体がオルガノイドであるかどうか、またそれが標的組織と一致しているかどうかをどのように判断すればよいですか?

オルガノイドの同定には、H&E染色、免疫組織化学（IHC）、単一細胞シークエンシングなどの方法があります。標的臓器や組織と一致するかどうかを判断するには、形態学的、組織病理学的、分子遺伝学的観点から多次元的に判断する必要があります。腫瘍オルガノイドの場合、特定のバイオマーカーを検出することで確認することができます。

 

Q: 培養中に観察されたオルガノイドの形態が文献で報告されているものと異なる場合、その理由は何でしょうか?

まず、サンプルのソースとサブタイプには個体差や異質性が存在する可能性があります。次に、誘導に使用される選択されたサイトカインと一部の小分子阻害剤の品質の違いにより、異なるオルガノイドの分化形態にばらつきが生じる可能性があります。文献の説明だけに頼るのではなく、HE 染色、IHC、遺伝子配列決定などの方法を使用して、オルガノイドの形態とソース組織との一貫性を確認することをお勧めします。

 

Q: オルガノイドを用いた薬剤感受性実験を行う場合、薬剤の溶媒として使用される DMSO の量を制御する必要がありますか?

はい、通常、薬剤感受性実験では DMSO の体積パーセントを 0.5% 未満にする必要があります。

 

Q: マトリックスゲルからオルガノイドを回収するにはどうすればいいですか?

以下の方法が推奨されます: (1) 市販のオルガノイド回収溶液 (CAT#41421ES) を使用すると、細胞や細胞表面タンパク質を損傷することなく、穏やかにかつ効果的に細胞懸濁液を得ることができます。 (2) マトリックスゲルを低温で解凍して柔らかくし、オルガノイドを放出することができます。

 

Q: 多くのオルガノイドは回収中に遠心管の壁に付着します。回収率を向上させるにはどうすればよいですか?

回収後に遠心分離する場合は、水平ローター遠心分離機を使用し、遠心速度を適宜上げてください。一般的には、遠心力300g程度、回転数1000～1200rpm程度が適しています。