SYBR Green 染料をベースにした Hieff ^™ Fast Cell Direct RT-qPCR キットは、RNA 抽出の必要がなく、あらゆる種類の動物細胞 (細胞系壁細胞や懸濁細胞、初代培養細胞、各種幹細胞、iPS 細胞など) からの RNA 抽出に適しており、qPCR 発現解析に直接使用でき、時間が短く、操作が簡単で、エラー率が低いです。テンプレートの準備から逆転写反応、遺伝子発現解析までの手順を完了するのに、わずか 1.5 時間しかかかりません。

キットには逆転写試薬と蛍光検出試薬が含まれているため、追加の試薬を購入することなく遺伝子発現解析に使用できます。

仕様

コンポーネント

ストレージ

FCD 溶解バッファーと FCD 洗浄バッファーは溶解し、汚染を防ぐために 4°C で保存しました。FCD 停止溶液、DNase I、4× Hifair™ FCD RT Mix、2× Hieff™ FCD qPCR SYBR マスターミックスは -25~-15℃ で保存する必要があります。

説明書

1. 分解産物の調製

1)1.試薬を室温で溶かし、使用前に逆さまにして軽く混ぜ、泡立ちを避けるために軽く遠心分離してから使用します*。

*試薬を混合しなかったり、混合にオシレーターを使用したり、試薬を氷上に配置しなかったりすると、反応のパフォーマンスが低下する可能性があります。

2)細胞の種類に応じて、細胞を遠心管に移し、5000 rpmで2分間遠心分離して細胞を集め、培地をよく吸引します。細胞が96ウェルプレートで培養されている場合は、培地を直接吸引することができます。

3)各ウェルにFCD洗浄バッファー150μLを加え、細胞を吹き付けて洗浄し、5000rpmで2分間遠心分離し、FCD洗浄バッファー***を吸引除去します。

4)各ウェルにFCD溶解緩衝液48μLとDNase Ⅰ液2μLを加え、室温で吹き混ぜ、5分間放置し、インキュベーション****後にFCD停止液2.5μLを加え、約5回吹き混ぜて切断産物*****を得る。

** 細胞数の基本的な要件は 1 ウェルあたり 1 × 10 ⁴細胞ですが、このキットは 1 × 10 ³ - 1 × 10 ⁶細胞の範囲で使用できます。細胞数が多い場合は、FCD Lysis Buffer 溶液と DNaseⅠ溶液の量を適宜比例して増やすことができます。

*** 遠心分離条件は細胞ごとに異なりますので、使用する細胞に適した速度で遠心分離してください。

**** 2.5 μL の FCD 停止溶液を 50 μL の溶解液に加え、必要に応じて FCD 停止溶液の量を増やします。

***** 細胞溶解産物溶液を長期保存する場合は、-20°C で保管してください。

5）Hifair™ FCD RT Mix 4 個を室温で溶かし、軽く転倒混和し、氷上に置き、以下の表に従って反応システムを構成します。

*******推奨使用量は 2 ～ 5 μL です。45% を超えないようにしてください。

1. 逆転写

上記で調製した反応溶液をピペットで軽く混合し、以下の表の手順に従って逆転写反応を実行します。

* 逆転写の推奨温度は55℃です。GC含有量の高いテンプレートや複雑なテンプレートの場合は、逆転写温度を60℃まで上げることができます。逆転写産物は、下流のRT-qPCR検出に直接使用できます。逆転写システムによるqPCR反応の阻害を避け、適切なCt値（10〜35）を得るために、産物を10〜1000倍に希釈してから使用できます。下流の実験を短時間行わない場合は、-20℃で保管できます。

1. 蛍光定量PCR

1）反応 システム 構成

反応溶液の調製（氷上での調製）には以下の比率が推奨されます。

*逆転写産物のRT-qPCR容量の1/10以上を加えないでください。テンプレートの濃度が高いと非特異的増幅が起こりやすいため、5〜50倍の適切な希釈率を使用してください。テンプレートの推奨量は4μLで、6μLを超えないようにしてください。反応性能が悪い場合は、プライマー濃度を0.2〜1.0μmol/Lの範囲で調整できます。

2）蛍光定量PCR増幅法（2段階法）

3）蛍光定量PCRの迅速増幅手順（2段階法）

* アニーリング/伸長温度と最終伸長時間は、実験要件に応じて適切に調整できます。高速プログラムはほとんどの遺伝子に適しており、標準プログラムは個々の複雑な二次構造遺伝子に対して試すことができます。

注記

1. この製品は研究目的にのみご使用いただけます。
2. 安全のため、白衣と使い捨て手袋を着用して作業してください。

バージョンEN20230908

ドキュメント:

マニュアル

11172-Hieff™ ファストセルダイレクト。EN20230908.pdf