Hieff NGS ^TM OnePot Pro DNA ライブラリ準備キット V3 は、 Illumina および MGI シーケンシング プラットフォーム用に特別に開発および設計された、新世代の酵素断片化ベースのライブラリ準備キットです。従来のライブラリ構築方法と比較して、この製品は高品質の断片化酵素を採用しており、面倒な超音波プロセスを排除しています。断片化モジュールと末端修復モジュールを 1 つに組み合わせることで、操作を簡素化します。さらに、ライゲーション モジュールの酵素とバッファーは事前に混合されているため、ライブラリ構築の時間とコストが大幅に削減されます。これにより、自動ライブラリ構築に適しています。このライブラリ準備キットは、優れたライブラリ変換率を備えており、一般的な動物、植物、微生物などのサンプル、および FFPE サンプルにも適用できます。前世代のライブラリ構築キットに基づいて、この製品は、以前のバージョンよりも断片化、末端修復、dA テーリング、アダプター ライゲーションの効率が高くなっています。高忠実度酵素により、増幅の均一性と忠実性が大幅に向上します。

仕様

コンポーネント

[注]: キットのコンポーネントは、IlluminaとMGIの両方のシーケンシングプラットフォームと互換性があります。完全なアダプターを使用した場合、Hieff NGS ^TM プライマー ミックス (Yeasen Cat#12190 または Cat#12191) が必要です。

ストレージ

この製品は-25〜-15℃で1年間保存する必要があります。

注記

1.操作について

1.安全のため、白衣と使い捨て手袋を着用して作業してください。

2. 室温で成分を解凍します。解凍後、ボルテックスでよく混ぜ、チューブを軽く回転させて、後で使用するために氷上に置いておきます。

3. 各ステップの反応溶液を調製する際は、ピペットを使用してよく混ぜるか、軽く振ることをお勧めします。激しく振るとライブラリ出力が低下する可能性があります。

4. 交差汚染を避けるために、フィルター付きのピペットチップを使用することを強くお勧めします。異なるサンプルを処理するときは、必ずピペットチップを交換してください。

5. 不適切な操作はエアロゾル汚染を引き起こし、結果の精度に影響を与える可能性が非常に高いです。PCR 反応混合領域と PCR 産物精製アッセイ領域を物理的に分離することを推奨します。ライブラリ構築用の専用ピペットなどの機器を装備します。0.5% 次亜塩素酸ナトリウムまたは 10% 漂白剤で表面を拭いて、各エリアの定期的な清掃を実行します。

6. この製品は研究目的にのみご使用ください。

2. DNAの断片化

1. このキットは 100 pg - 1000 ng の入力 DNA に対応しています。A260/A280 = 1.8-2.0 の高品質の入力 DNA を使用することを強くお勧めします。

2. 入力 DNA に金属キレート剤などの高濃度の塩が導入されると、その後の実験に影響が出る可能性があります。断片化のために DNA サンプルを ddH ₂ O で溶出することをお勧めします。

3. 標準 DNA サンプルの断片化時間については、表 6 を参照してください。このキットは断片化バイアスが低く、幅広い GC 組成の DNA サンプルに対して均一な GC カバレッジを提供します。実験要件に基づいて断片化時間を調整してください。

4. 正確な断片化のために、反応を氷上で準備してください。

3.アダプターライゲーション

1. お客様は、実験要件に応じて、Illumina または MGI ロング アダプター (バーコード アダプター) キットとショート アダプター キットを選択できます。

2. 高品質の市販のアダプターを選択することをお勧めします。自作のアダプターを選択する場合は、NGSプライマー合成の経験がある会社に委託し、厳格な汚染管理の必要性に留意してください。また、クロスコンタミネーションを防ぐために、クリーンベンチでDNAアニーリング溶液を調製し、毎回1種類のアダプターのみを操作することをお勧めします。

3. アダプターは氷の上または 4°C で解凍してください。室温で操作する場合は、アダプターの変性を防ぐために、実験室の温度が 25°C を超えないようにしてください。

4. アダプターの品質と濃度は、ライゲーション効率とライブラリ収量に直接影響します。アダプターの濃度が高すぎるとアダプター二量体の形成が促進され、アダプターが低すぎるとライゲーション速度とライブラリ収量が低下します。アダプターを使用する場合、入力 DNA 量に応じて TE バッファーで希釈します。表 1-2 は、イルミナまたは MGI シーケンシング プラットフォームでこのキットを使用した場合の、入力 DNA のさまざまな量に対する従来型アダプターと UMI アダプターの推奨希釈方法を示しています。

表1 異なる入力DNAに対するイルミナの推奨アダプター量

表2 異なる入力DNAに対する推奨MGIアダプター量

4.ビーズベースのDNAクリーンアップとサイズ選択

1. DNA サイズ選択は、末端修復/dA テーリングの前、アダプター連結後、または増幅後に実行できます。

2. 入力 DNA 量が 50 ng を超える場合は、アダプター連結直後にサイズ選択を実行することをお勧めします。それ以外の場合は、増幅後にサイズ選択を実行してください。

3. ライゲーションエンハンサーには高濃度の PEG が含まれており、正確なサイズ選択に重大な影響を及ぼす可能性があります。したがって、アダプターライゲーションの直後にサイズ選択を実行する場合は、サイズ選択の前にビーズクリーンアップステップを追加することを強くお勧めします。サイズ選択ステップは、エンド修復/dA テーリングの前、またはライブラリ増幅後に実行する場合は直接実行できます。

4. 磁気ビーズは使用前に室温で平衡化する必要があります。そうしないと、収量が減少し、サイズ選択効果に影響が出ます。

5. 磁気ビーズは使用前にボルテックスまたはピペッティングでよく混ぜてください。

6. 上清を移すときにビーズを吸引しないでください。微量のビーズでも次の反応に影響を与える可能性があります。

7. 80% エタノールは新しく調製する必要があります。そうでないと回収効率に影響します。

8. 正確なサイズ選択を行うには、100 μL 以上の容量から始めることをお勧めします。容量がそれより少ない場合は、超純水で容量を 100 μL まで増やすことをお勧めします。

9. 磁気ビーズは、生成物を溶出する前に室温で乾燥させる必要があります。乾燥が不十分だと、残留エタノールが後続の反応に影響を与えやすくなります。乾燥が過剰だと、磁気ビーズが割れて精製収率が低下します。通常、室温で 3 ～ 5 分間乾燥させると、ビーズが完全に乾燥します。

10. 必要に応じて、0.1× TE バッファーで溶出した精製またはサイズ選択された DNA サンプルは、4°C で 1 ～ 2 週間、または -20°C で 1 か月間保存できます。

5.ライブラリの拡張

1. ライブラリ増幅を実行するかどうかは、DNA入力量、アダプターの種類、シーケンスデータアプリケーションなどによって異なります。部分アダプターを使用する場合は、増幅ステップが必要です。全長アダプターを使用する場合、入力DNAが<200 ngの場合は増幅を実行することをお勧めします。それ以外の場合は、増幅は必要ありません。

2. 増幅サイクル数は厳密に制御する必要があります。増幅が不十分だとライブラリ収量が低下する可能性があり、増幅が多すぎるとバイアス、エラー、重複読み取り、キメラ産物の増加を招く可能性があります。表 3 に、ライブラリ収量 1 μg を目標とした推奨サイクル数を示します。

表3 1,000 ngのライブラリー収量を生成するための推奨サイクル数

注記

1.表3は、約200bpの高品質Input DNAテストを使用したループパラメータの数を示しています。FFPE DNAの品質は大きく異なり、DNAの品質が悪い場合やライブラリの長さが長い場合は、十分なライブラリを得るためにサイクル数を適切に増やす必要があります。

2. ライブラリ構築プロセス中にサイズ選択が必要な場合は、ライブラリ増幅のサイクル数を高くすることをお勧めします。それ以外の場合は、サイクル数を低くすることをお勧めします。

3. 不完全なアダプターを使用する場合は、完全なアダプターを形成するために少なくとも 2 サイクルを増幅する必要があります。

6.ライブラリ品質分析

1. 構築されたライブラリの品質は、通常、濃度とサイズ分布を測定することによって分析されます。

2. ライブラリの濃度は、Qubit や PicoGreen などの蛍光ベースの方法や qPCR によって測定できます。

3. NanoDrop などの吸光度ベースの定量化方法の使用は推奨されません。

4. ライブラリの定量化には qPCR 法を使用することをお勧めします。Qubit や PicoGreen などの蛍光ベースの方法では、不完全な dsDNA 構造 (アダプターのない挿入物、または片方の端のみがアダプターで連結された挿入物) を完全なライブラリと区別できません。qPCR 法では、両端がアダプターで連結された完全なライブラリ (シーケンス可能なライブラリ) のみを増幅して測定するため、ローディングのより正確な測定が可能になります。

5. ライブラリのサイズ分布は、Agilent Bioanalyzer またはキャピラリー電気泳動やマイクロ流体の原理に基づくその他のデバイスを使用して分析できます。

7.その他の資料

1. DNA 精製磁気ビーズ: Hieff NGS ^TM DNA 選択ビーズ (Yeasen Cat#12601) または AMPure ^® XP ビーズ (A63880) またはその他の同等製品。

2. アダプター: Illumina 用完全アダプター: Yeasen Cat#13519-13520; 384 デュアル CDI プライマー: Yeasen Cat#12412~Cat#12413; 384 ユニークデュアルインデックス (UDI) プライマー: Yeasen Cat#12312~Cat#12315; UMI UDI アダプター: Yeasen Cat#13370~Cat#13371; MGI 用完全アダプター: Yeasen Cat#13360-13362。DNA プライマー ミックス: Cat#12190 または Cat#12191。

3. ライブラリ品質分析: Agilent 2100 Bioanalyzer DNA 1000 Chip/High Sensitivity Chip または同等の製品、ライブラリ定量試薬。

4. その他の材料：無水エタノール、滅菌超純水、低保持ピペットチップ、PCRチューブ、磁気スタンド、サーマルサイクラーなど。

8.ワークフロー

図1. OnePot Pro DNAライブラリ準備キットのワークフロー

数字

異なる断片化条件下で得られた挿入断片のサイズ

このキットを使用して、500 ng の標準 gDNA をテンプレートとして使用し、ライブラリを構築しました。断片化条件は、32°C、35°C、37°C​​ でそれぞれ 5、10、15、20、30 分間の酵素消化でした。断片化された生成物は 1.2x 磁気ビーズで精製され、21 μL の ddH ₂ O で溶出されました。濃度は Qubit を使用して測定され、回収された挿入断片の分布は次の図に示されています。

図2. 32°Cでの異なる酵素消化時間におけるライブラリプロファイル

図3. 35℃における異なる酵素消化時間でのライブラリプロファイル 

図4. 37℃における異なる酵素消化時間でのライブラリプロファイル