Hieff NGS® DNA&RNA ライブラリ共同準備キット V2は、効率的なcDNA合成試薬と酵素消化試薬を含む、Illumina®およびMGI®シーケンシングプラットフォーム用のDNA＆RNA共ライブラリーキットです。従来のライブラリー構築方法と比較して、この製品はcDNA合成とDNA＆RNAライブラリーを効率的に完了できます。 1 本のチューブで構築できます。キットには DNA 断片化用の高品質酵素が含まれており、DNA 断片化、末端修復、dA テーリングを 1 つのステップに統合することで、ライブラリの準備にかかる時間とコストを大幅に削減します。 このライブラリ調製キットは、ライブラリ変換率が非常に高く、一般的な動物、植物、微生物などのサンプル、および FFPE サンプルにも適用できます。最新の最適化されたリガーゼを使用したこのアップグレードされたキットは、アダプターライゲーション中の自己ライゲーション率を大幅に低減します。さらに、新しい高忠実度ポリメラーゼの導入により、増幅の均一性と忠実度がさらに向上します。

キットで提供されるすべてのコンポーネントは厳格な品質管理と機能検証を受けており、ライブラリ構築の安定性と再現性が最大限に保証されます。

仕様

コンポーネント

注: *は、この試薬がこのキットに含まれておらず、追加の試薬が必要であることを示しています。キット Illumina ^®と MGI ^®のデュアル プラットフォームと互換性がありますが、追加のプライマー ミックス (CAT # 13334 Primer Mix for MGI ^®および Cat# 13335 Primer Mix for Illumina ^® ) が必要です。

ワークフロー:

ストレージ

この製品は-25～-15℃で保管してください。 1年。

注記

操作について

1. 1. 安全のため、白衣と使い捨て手袋を着用して操作してください。
2. 室温でコンポーネントを解凍します。解凍後、ボルテックスでよく混ぜ、チューブを軽く回転させて、後で使用するために氷の上に置いておきます。
3. 各反応ステップは、加熱蓋付きのサーモサイクラーで実行することをお勧めします。サーモサイクラーは、使用前に設定温度まで予熱しておく必要があります。
4. RNaseを含まない消耗品を使用してください汚染を防ぎ、実験エリアを定期的に清掃してください。RNase 汚染を除去するには、ThermoFisher の RNAZap ^TM高効率核酸除去スプレーの使用が推奨されました。
5. 不適切な操作はエアロゾル汚染を引き起こし、結果の精度に影響を与える可能性が非常に高くなります。PCR 反応混合領域と PCR 産物精製アッセイ領域を物理的に分離することを必須とすることをお勧めします。ライブラリ構築用の特殊なピペットなどの機器を備えています。
6. 6. この製品は研究目的にのみご使用ください。

アダプターライゲーション

1. 実験要件に応じて、Illumina または MGI ロング アダプター (バーコード アダプター) キットとショート アダプター キットを選択できます。
2. 高品質の市販のアダプターを選択することをお勧めします。自作のアダプターを選択する場合は、NGSプライマー合成の経験がある会社に委託し、厳格な汚染管理の必要性に留意してください。また、クロスコンタミネーションを防ぐために、クリーンベンチでDNAアニーリング溶液を調製し、毎回1種類のアダプターのみを操作することをお勧めします。
3. アダプターは氷の上または 4°C で解凍してください。室温で操作する場合は、アダプターの変性を防ぐために、実験室の温度が 25°C を超えないようにしてください。
4. アダプターの濃度はライゲーション効率とライブラリー収量に直接影響します。キットに加えるアダプターの量は 5 μl に固定されています。アダプターは 0.1×TE バッファーで希釈することが推奨され、希釈したアダプターは 4°C で 48 時間保存できます。表1 には、入力 RNA の量に応じて推奨されるアダプターの量がリストされています。

表1-1 異なる入力に対するイルミナ^®アダプタの推奨量 DNAとRNA

表1-2 異なる入力に対する推奨^MGI®アダプタ量 DNAとRNA

*アダプターの使用は、Total RNA サンプルの種類と入力量に応じて調整できます。

ライブラリの拡張

増幅サイクル数は厳密に制御する必要があります。増幅が不十分だとライブラリ収量が低下する可能性があり、増幅が多すぎるとバイアス、エラー、重複読み取り、キメラ産物の増加につながる可能性があります。表 2 には、ライブラリ収量 1 μg を目標とした推奨サイクル数を示します。

テーブル 2 DNA&RNAライブラリを生成するための推奨サイクル数*

注：*ライブラリの収量は、入力量と増幅サイクル数に関係するだけでなく、サンプルの品質、断片化条件、ソート条件によっても影響を受けます。ライブラリ構築の過程では、実際の状況に応じて最も適切な条件を選択してください。

ビーズベースのDNAクリーンアップとサイズ選択

1. 1. ライブラリ構築プロセスには、DNA 精製磁気ビーズを必要とするステップが複数あります。DNA 精製とサイズ選択には、Hieff NGS™ DNA 選択ビーズ (Yeasen カタログ番号 12601) または AMPure® XP 磁気ビーズ (Beckman カタログ番号 A63880) をお勧めします。
2. 2. 磁気ビーズは使用前に室温で平衡化する必要があります。そうしないと、収量が減少し、サイズ選択効果に影響が出ます。
3. 3. 磁気ビーズは使用前にボルテックスまたはピペッティングでよく混ぜてください。
4. 4.上清を移す際にビーズを吸引しないでください。微量のビーズでもその後の反応に影響を与える可能性があります。
5. 5.80% エタノールは新しく調製する必要があります。そうでないと、回収効率に影響します。
6. 6. 磁気ビーズは、生成物を溶出する前に室温で乾燥させる必要があります。乾燥が不十分だと、残留エタノールが後続の反応に影響を与えやすくなります。乾燥が過剰だと、磁気ビーズが割れて精製収率が低下します。通常、室温で 3 ～ 5 分間乾燥させると、ビーズが完全に乾燥します。
7. 7.必要に応じて、精製またはサイズ選択されたDNAサンプルを1× TE バッファーは 4°C で 1 ～ 2 週間、または -20°C で 1 か月間保存できます。

ライブラリ品質分析

1. 構築されたライブラリの品質は、通常、濃度とサイズ分布を測定することによって分析されます。
2. ライブラリの濃度は、Qubit や PicoGreen などの蛍光ベースの方法や qPCR によって測定できます。
3. NanoDrop などの吸光度ベースの定量化方法を使用することはお勧めしません。
4. ライブラリの定量化には qPCR 法を使用することをお勧めします。Qubit や PicoGreen などの蛍光ベースの方法では、不完全な dsDNA 構造 (アダプターのない挿入物、または片方の端のみがアダプターで連結された挿入物) を完全なライブラリと区別できません。qPCR 法では、両端がアダプターで連結された完全なライブラリ (シーケンス可能なライブラリ) のみを増幅して測定するため、より正確なローディング測定が行えます。
5. ライブラリのサイズ分布は、Agilent Bioanalyzer またはキャピラリー電気泳動やマイクロ流体の原理に基づくその他のデバイスを使用して分析できます。

その他の資料

1. 1. DNA 精製磁気ビーズ: Hieff NGS™ DNA 選択ビーズ (Yeasen Cat#12601) または AMPure ^® XP ビーズ (A63880) またはその他の同等製品。

2. アダプタ: Illumina 用完全アダプタ (Yeasen Cat#13519-13520 または同等の他の製品) または MGI 用完全アダプタ (Yeasen Cat#13360-13362 または同等の他の製品)。

3. ライブラリ品質分析: Agilent 2100 Bioanalyzer DNA 1000 Chip/High Sensitivity Chip またはその他の同等製品、ライブラリ定量試薬。
4. その他の材料: 無水エタノール、滅菌超純水、低保持ピペットチップ、PCR チューブ、磁気スタンド、サーマルサイクラーなど。

ドキュメント:

マニュアル

12305ES-Hieff NGS® DNA&RNA ライブラリ共同準備キット V2.pdf