製品説明

Hieff NGS™ Ultima デュアルモード RNA ライブラリ準備キットは、Illumina® および MGI® シーケンシング プラットフォーム用のトータル RNA シーケンシング ライブラリ構築キットで、RNA 断片化試薬、逆転写試薬、従来型および鎖特異的な ds-cDNA 合成試薬、ライブラリ増幅試薬が含まれています。シーケンシング ライブラリは、mRNA 精製キットまたは rRNA 除去キットに続いて構築できます。2 鎖合成モジュールには、従来のライブラリまたは鎖特異的ライブラリのニーズを満たす 2 つのバッファーが装備されています。その中で、鎖特異的な 2 鎖合成バッファーでは dTTP が dUTP に置き換えられているため、cDNA の 2 番目の鎖に dUTP を追加できます。このキットで使用されている高忠実度 DNA ポリメラーゼは、ウラシルを含む DNA テンプレートを増幅できず、鎖特異性を実現します。提供されるすべての試薬は厳格な品質管理と機能検証を受けており、ライブラリ構築の安定性と再現性が最大限に保証されています。

ワークフロー

製品構成

注意: このキットは Illumina および MGI プラットフォームの両方と互換性がありますが、追加の Illumina または MGI プライマー ミックス (Illumina の場合は Cat# 13335 プライマー ミックス、MGI の場合は Cat# 13334 プライマー ミックス) が必要です。

配送と保管

ボックス I の Hieff NGS™ Ultima デュアルモード mRNA ライブラリ準備キットのコンポーネントはアイスパックとともに出荷され、2 ～ 8°C で 1 年間保存できます。
ボックス II の Hieff NGS™ Ultima デュアルモード mRNA ライブラリ準備キットのコンポーネントはドライアイスとともに出荷され、-20°C で 1 年間保存できます。

注意事項

1 操作
1.1 安全と健康のため、この製品を使用する際は、実験着や使い捨て手袋などの個人用保護具 (PPE) を着用してください。この製品は研究目的のみにご使用ください。
1.2 室温で成分を解凍します。上下に数回反転させてよく混ぜ、軽くスピンダウンして氷上に置いて使用します。
1.3 各ステップの反応は、加熱蓋付きのサーマルサイクラーで実行することをお勧めします。サーマルサイクラーは、使用前に設定温度まで予熱しておく必要があります。
1.4 RNase汚染のない供給品と実験エリアの定期的な清掃が必要です。
1.5 不適切な操作はエアロゾル汚染を引き起こし、結果の精度に影響を与える可能性が非常に高くなります。PCR 反応混合領域と PCR 産物精製アッセイ領域を物理的に分離することを必須とすることをお勧めします。ライブラリ構築用の特殊なピペットなどの機器を備えています。
2 アダプターライゲーション
2.1 イルミナまたは MGI ロング アダプター (バーコード アダプター) キットとショート アダプター キットが用意されており、お客様は実験要件に応じて選択できます。
2.2 高品質の市販のアダプターを選択することをお勧めします。自作のアダプターを選択する場合は、NGSプライマー合成の経験がある会社に委託し、厳格な汚染管理の必要性について言及してください。また、クロスコンタミネーションを防ぐために、クリーンベンチでDNAアニーリング溶液を調製し、毎回1種類のアダプターのみを操作することをお勧めします。
2.3 アダプターは氷の上または 4°C で解凍してください。室温で操作する場合は、アダプターの変性を防ぐために、実験室の温度が 25°C を超えないようにしてください。
2.4 アダプターの濃度は、ライゲーション効率とライブラリ収量に直接影響します。キットに添加されるアダプターの量は 5 μl に固定されています。アダプターは 0.1×TE バッファーで希釈することが推奨されており、希釈したアダプターは 4°C で 48 時間保存できます。表 1 に、入力 RNA のさまざまな量に対する推奨アダプター量を示します。

表1-1 異なる入力RNAに対するイルミナアダプターの推奨量

表1-2 異なる入力RNAに対する推奨MGI®アダプター量

*アダプターの使用は、Total RNA サンプルの種類と入力量に応じて調整できます。

3 ライブラリの増幅

3.1 キットに含まれる高忠実度 DNA ポリメラーゼは、第 1 世代 DNA ポリメラーゼをベースに、増幅の均一性が大幅に向上し、増幅バイアスが見られません。
3.2 インデックス アダプター (ロング アダプターまたはラージ Y アダプターとも呼ばれます) がターゲット DNA に連結されている場合は、このキットに付属のプライマー ミックスを増幅に使用できます。DNA 連結に「ショート アダプター」または「スモール Y アダプター」を使用する場合は、増幅にインデックス プライマーが必要です。
3.3 増幅サイクル数は厳密に制御する必要があります。増幅が不十分だとライブラリ収量が低下する可能性があり、増幅が多すぎるとバイアス、エラー、重複読み取り、キメラ産物、拡張変異の蓄積が増加する可能性があります。表 2 に PCR 増幅の推奨サイクル数を示します。

表2 RNAライブラリを生成するための推奨サイクル数*

注:*ライブラリの収量は、入力量と増幅サイクル数に関係するだけでなく、サンプルの品質、断片化条件、ソート条件によっても影響を受けます。ライブラリ構築の過程では、実際の状況に応じて最も適切な条件を選択してください。

4 ビーズベースのDNAクリーンアップとサイズ選択

4.1 ライブラリ構築プロセスには、DNA 精製磁気ビーズを必要とするステップが複数あります。DNA 精製とサイズ選択には、Hieff NGS™ DNA 選択ビーズ (Yeasen カタログ番号 12601) または AMPure® XP 磁気ビーズ (Beckman カタログ番号 A63880) をお勧めします。
4.2 磁性ビーズは使用前に室温で平衡化する必要があります。そうしないと、収量が減少し、サイズ選択効果が影響を受けます。
4.3 磁気ビーズは使用前にボルテックスまたはピペッティングでよく混合する必要があります。
4.4 上清を移す際にビーズを吸引しないでください。微量のビーズでもその後の反応に影響を及ぼす可能性があります。
4.5 80% エタノールは新しく調製する必要があります。そうでないと回収効率に影響します。
4.6 磁気ビーズは、生成物を溶出する前に室温で乾燥させる必要があります。乾燥が不十分だと、残留エタノールが後続の反応に影響を与えやすくなります。乾燥が過剰だと、磁気ビーズが割れて精製収率が低下します。通常、室温で 3 ～ 5 分間乾燥させると、ビーズが完全に乾燥します。
4.7 必要に応じて、TE バッファーで溶出された精製またはサイズ選択された DNA サンプルは、4°C で 1 ～ 2 週間、または -20°C で 1 か月間保存できます。
5 ライブラリ品質分析
5.1 通常、構築されたライブラリの品質は、長さの分布と濃度の検出によって評価できます。
5.2 ライブラリ濃度検出：Qubit®、PicoGreen®などの二本鎖DNA蛍光色素に基づく方法、qPCRに基づく絶対定量。
5.3 NanoDrop®などのスペクトル検出に基づく方法は、ライブラリ濃度検出には適用できません。
5.4 ライブラリ濃度検出にはqPCRが推奨されます。Qubit®、PicoGreen®、および二本鎖DNA蛍光色素に基づくその他の方法では、片方の端でアダプターに連結された産物、両端でアダプターに連結されていない産物、およびその他の不完全な二本鎖産物を効果的に区別することはできません。qPCRの絶対定量はPCR増幅の原理に基づいており、片端または両端の端でアダプターに連結されていない非シーケンシングライブラリの干渉を除外し、サンプルの両端のアダプターの完全なライブラリ（シーケンス可能なライブラリ）のみを定量します。
5.5 ライブラリ長分布の検出は、Agilent Bioanalyzer 2100 や、キャピラリー電気泳動またはマイクロ流体の原理に基づくその他の機器によって実行できます。

ドキュメント:

安全データシート

12308-コンポーネントA-MSDS-HB22803.pdf

12308-コンポーネントB-MSDS-HB220803.pdf

12308-コンポーネントC-MSDS-HB220803.pdf

12308-コンポーネントD-MSDS-HB220803.pdf

12308-コンポーネント E-MSDS-HB220803.pdf

12308-コンポーネント F-MSDS-HB220803.pdf

12308-コンポーネント G-MSDS-HB220803.pdf

12308-コンポーネントH-MSDS-HB220803.pdf

12308-コンポーネントI-MSDS-HB220803.pdf

12308-コンポーネント K-MSDS-HB220803.pdf

マニュアル

12308ES-Hieff NGS™ Ultima デュアルモード RNA ライブラリ調製キット-Ver.EN20230327.pdf

引用と参考文献:

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