Hieff NGS ^TM DNA ライブラリ準備キットは、 Illumina ® および MGI ® シーケンシング プラットフォーム用に特別に開発および設計された新世代のライブラリ構築キットです。前世代のライブラリ構築キットをベースにしたこの製品は、末端修復、dA テーリング、アダプター連結において、以前のバージョンよりも高い効率を示します。高忠実度酵素により、増幅の均一性と忠実度が大幅に向上します。このキットは、動物/植物/微生物の標準ゲノム DNA、FFPE サンプル、cfDNA、ChIP DNA など、ほとんどの DNA サンプル タイプと互換性があります。

仕様

コンポーネント

ストレージ

この製品は-25〜-15℃で1 年間保存する必要があります。

注記

1. 操作について

1. 安全のため、白衣と使い捨て手袋を着用して作業してください。

2. 室温で成分を解凍します。解凍後、ボルテックスでよく混ぜ、チューブを軽く回転させて、後で使用するために氷上に置いておきます。

3.各ステップの反応溶液を調製する際は、ピペットを使用してよく混ぜるか、軽く振ることをお勧めします。激しく振るとライブラリ出力が低下する可能性があります。

4.交差汚染を避けるために、フィルター付きのピペットチップを使用することを強くお勧めします。異なるサンプルを処理するときは、必ずピペットチップを交換してください。

5. 不適切な操作はエアロゾル汚染を引き起こし、結果の精度に影響を与える可能性が非常に高いです。PCR反応混合領域とPCR産物精製アッセイ領域を物理的に分離することが推奨されます。ライブラリ構築用の専用ピペットなどの機器を装備しています。0.5 %次亜塩素酸ナトリウムまたは10%漂白剤で表面を拭いて、各エリアの定期的な清掃を実行します。

6. この製品は研究目的にのみご使用ください。

2. DNAの断片化

1.このキットは、機械的に断片化された DNA または酵素的に断片化された DNA のいずれにも対応しています。

2.このキットは 100 pg ～ 1000 ng の入力 DNA に対応しています。A260/A280 = 1.8 ～ 2.0 の高品質入力 DNA を使用することを強くお勧めします。表 1 に入力 DNA の推奨量を示します。

表1 推奨される入力DNA量

注意: 入力 DNA の品質が悪い場合、または DNA サイズの選択が必要な場合は、それに応じて入力 DNA の量を増やす必要があります。

3. 「入力 DNA」とは、具体的には末端修復/dA テーリングの準備が整った DNA サンプルを指します。

4.入力 DNA サンプルに金属キレート剤などの高濃度の塩が含まれている場合は、断片化後にビーズ精製/サイズ選択ステップを実行することをお勧めします。塩は、末端修復や dA テーリングなどの後続の反応の効率に影響を与える可能性があります。機械的断片化法を使用する場合は、断片化のために滅菌超純水ではなく TE バッファーで DNA サンプルを溶出してください。ライブラリの準備に進む前にビーズのクリーンアップやサイズ選択を実行せずに酵素断片化法を使用する場合は、使用する停止バッファーに過剰な金属キレート剤が含まれていないことを確認してください。それ以外の場合は、断片化されたサンプルをクリーンアップまたはサイズ選択し、TE バッファーまたは滅菌超純水 (≤50 μL) で溶出してから、ライブラリの準備に進んでください。

3. アダプターライゲーション

1.イルミナまたはMGIロングアダプター（バーコードアダプター）キットとショートアダプターキットは、 お客様の実験要件に応じて選択できます。

2 . 高品質の市販のアダプターを選択することをお勧めします。自作のアダプターを選択する場合は、NGSプライマー合成の経験がある会社に委託し、厳格な汚染管理の必要性に留意してください。また、クロスコンタミネーションを防ぐために、クリーンベンチでDNAアニーリング溶液を調製し、毎回1種類のアダプターのみを操作することをお勧めします。

3 . アダプターは氷上または 4°C で解凍してください。室温で操作する場合は、アダプターの変性を防ぐために、実験室の温度が 25°C を超えないようにしてください。

4 . アダプターの品質と濃度は、ライゲーション効率とライブラリ収量に直接影響します。アダプターの濃度が高すぎるとアダプター二量体の形成が促進され、アダプターが低すぎるとライゲーション速度とライブラリ収量が低下します。アダプターを使用する場合、入力 DNA 量に応じて TE バッファーで希釈します。表 2 -5に、このキットを使用したさまざまな入力 DNA 量に対する推奨アダプター希釈方法を示します。

表2 異なる入力DNAに対するIllumina ^TMアダプターの推奨量

表3 異なる入力DNAに対する推奨MGI ^TMアダプター量

表4 推奨されるIllumina ^TM 異なる入力DNAに対するUMIアダプターの量

表5 異なる入力DNAに対する推奨MGI ^TM UMI アダプタ量

4.ビーズベースのDNAクリーンアップとサイズ選択

1. DNA サイズ選択は、末端修復/dA テーリングの前、アダプター連結後、または増幅後に実行できます。

2.入力 DNA 量が 50 ng を超える場合は、アダプター連結直後にサイズ選択を実行することをお勧めします。それ以外の場合は、増幅後にサイズ選択を実行してください。

3.ライゲーションエンハンサーには高濃度のPEGが含まれており、正確なサイズ選択に重大な影響を及ぼす可能性があります。したがって、アダプターライゲーションの直後にサイズ選択を行う場合は、サイズ選択の前にビーズのクリーンアップステップを追加することを強くお勧めします。サイズ選択ステップは、エンド修復/dAテーリングの前、またはエンド修復/dAテーリングの後に実行する場合は直接実行できます。 ライブラリの増幅。

4.磁気ビーズは使用前に室温で平衡化する必要があります。そうしないと、収量が減少し、サイズ選択効果に影響が出ます。

5.磁気ビーズは使用前にボルテックスまたはピペッティングでよく混ぜてください。

6.上清を移すときにビーズを吸引しないでください。微量のビーズでも次の反応に影響を与える可能性があります。

7. 80% エタノールは新しく調製する必要があります。そうでないと回収効率に影響します。

8.正確なサイズ選択を行うには、100 μL 以上の容量から始めることをお勧めします。容量がそれより少ない場合は、超純水で容量を 100 μL まで増やすことをお勧めします。

9.磁気ビーズは、生成物を溶出する前に室温で乾燥させる必要があります。乾燥が不十分だと、残留エタノールが後続の反応に影響を与えやすくなります。乾燥が過剰だと、磁気ビーズが割れて精製収率が低下します。通常、室温で 3 ～ 5 分間乾燥させると、ビーズが完全に乾燥します。

10.必要に応じて、 0.1× TEバッファーで溶出した精製またはサイズ選択されたDNAサンプルは、 4°Cで1〜2週間、または-20°Cで1か月間保存できます。

5. ライブラリの拡張

1.ライブラリ増幅を実行するかどうかは、DNA入力量、アダプターの種類、シーケンスデータアプリケーションなどによって異なります。部分アダプターを使用する場合は、増幅ステップが必要です。全長アダプターを使用する場合、入力DNAが200 ng未満の場合は増幅を実行することをお勧めします。それ以外の場合は、増幅は必要ありません。

2. 増幅サイクル数は厳密に制御する必要があります。増幅が不十分だとライブラリ収量が低下する可能性があり、増幅が多すぎるとバイアス、エラー、重複読み取り、キメラ産物の増加を招く可能性があります。表6 に、ライブラリ収量 1 μg を目標とした推奨サイクル数を示します。

表6 1,000 ngのライブラリー収量を生成するための推奨サイクル数

注記：

1.表6は、約200bpの高品質Input DNAテストを使用したループパラメータの数を示しています。FFPE DNAの品質は大きく異なり、DNAの品質が悪い場合やライブラリの長さが長い場合は、十分なライブラリを得るためにサイクル数を適切に増やす必要があります。

2.ライブラリ構築プロセス中にサイズ選択が必要な場合は、ライブラリ増幅のサイクル数を高くすることをお勧めします。それ以外の場合は、サイクル数を低くすることをお勧めします。

3.不完全なアダプターを使用する場合は、完全なアダプターを形成するために少なくとも 2 サイクルを増幅する必要があります。

6. ライブラリ品質分析

1. 構築されたライブラリの品質は、通常、濃度とサイズ分布を測定することによって分析されます。

2. ライブラリの濃度は、Qubit や PicoGreen などの蛍光ベースの方法や qPCR によって測定できます。

3. NanoDrop などの吸光度ベースの定量化方法の使用は推奨されません。

4. ライブラリの定量化には qPCR 法を使用することをお勧めします。Qubit や PicoGreen などの蛍光ベースの方法では、不完全な dsDNA 構造 (アダプターのない挿入物、または片方の端のみがアダプターで連結された挿入物) を完全なライブラリと区別できません。qPCR 法では、両端がアダプターで連結された完全なライブラリ (シーケンス可能なライブラリ) のみを増幅して測定するため、ローディングのより正確な測定が可能になります。

5. ライブラリのサイズ分布は、Agilent Bioanalyzer またはキャピラリー電気泳動やマイクロ流体の原理に基づくその他のデバイスを使用して分析できます。

7. その他の資料

1. DNA精製磁気ビーズ：Hieff NGS ^TM DNA 選択ビーズ（Yeasen Cat#12601）またはAMPure ^® XPビーズ（A63880）またはその他の同等製品。

2. アダプタ: Illumina 用完全アダプタ: Yeasen Cat#13519-13520 ; 384 デュアル CDI プライマー: Yeasen Cat#12412~Cat#12413 ; 384 ユニーク デュアル インデックス (UDI) プライマー: Yeasen Cat#12 312 ~Cat#12 315 ; UMI UDI アダプター: Yeasen Cat#13370~Cat#13371 ; MGI 用完全アダプター: Yeasen Cat#13360-13362。DNA プライマー ミックス: Cat# 12190 またはCat# 12191 。

3.ライブラリ品質分析: Agilent 2100 Bioanalyzer DNA 1000 Chip/High Sensitivity Chip または同等の製品、ライブラリ定量試薬。

4.その他の材料：無水エタノール、滅菌超純水、低保持ピペットチップ、PCRチューブ、磁気スタンド、サーマルサイクラーなど。

説明書

ステップ 1.修復/dA-Taling の終了

1.表7に記載されている試薬を解凍します。試薬を逆さまにして完全に混合し、後で使用するために氷の上に置いておきます。

2. 表7 に従って試薬を氷上で混ぜ合わせます。

表7末端修復/dA-テーリング反応系

3. ピペッティングまたは振盪により​​穏やかに混合し、軽く遠心分離して溶液を落とします。

4. チューブをサーモサイクラーにセットし、表8に従ってプログラムを設定します。

表8末端修復/dA-テーリング反応プログラム

ステップ2.アダプターライゲーション

1.表2-5に従ってアダプターを適切な濃度に希釈します。

2.表9に記載されている試薬を解凍します。試薬を逆さまにして完全に混ぜ、後で使用するために氷の上に置いておきます。

3. 表9 に従って試薬を氷上で混ぜ合わせます。

表9アダプターライゲーション反応システム

注意: *Ligation Enhancer は粘性があります。 使用前に転倒または頂点撹拌して十分に混合し、軽く遠心分離してください。

** イルミナ^TM の元の濃度 YEASEのアダプターは15μMです。投入量に応じてアダプターを希釈し、 アダプターの容量を5μLに固定してください。

** MGI ^TM の元の濃度 YEASEのアダプターは10μMです。 投入量に応じてアダプターを希釈し、 アダプターの容量を5μLに固定してください。

4. ピペッティングで静かに上下させてよく混ぜ、軽くスピンダウンしてチューブの側面に付いた液体をすべて集めます。

5. 表10 に示すように予熱したサーマルサイクラーでサンプルをインキュベートし、アダプター接続反応を実行します。

表10 アダプターライゲーション反応プログラム

ステップ3.アダプターライゲーション後のクリーンアップまたはサイズ選択

このステップでは、磁気ビーズを使用してステップ2 の生成物を精製またはサイズ選択します。精製により、残留アダプター、アダプター ダイマー、またはその他の使用できない生成物を除去できます。

アダプター連結DNAのクリーンアップ

1. 準備: Hieff NGS ^TMを受験する DNA 選択ビーズを冷蔵庫から取り出し、室温で少なくとも 30 分間平衡化します。80% エタノールを新しく準備します。

2. ビーズを反転または頂点を合わせてよく混ぜます。

3. 88 を加える アダプター連結産物を含むチューブに、 Hieff NGS ^TM DNA選択ビーズ（0.8 × 、ビーズ：DNA = 0.8 ： 1 ）を1μL 加え、よく振って混ぜ、室温で5分間インキュベートします。

4. 軽く遠心分離して溶液を落とし、遠心管を磁気ラックに置きます。磁気ビーズが完全に吸着したら（約 5 分）、慎重に液体を取り除きます。

5. チューブを磁気スタンドに置き、 新しく調製した 80% エタノール 200 μL をチューブに直接加えます。室温で 30 秒間インキュベートし、液体を慎重に除去します。

6. 繰り返し ステップ5をもう一度。

7. チューブを磁気スタンドに置いたまま、キャップを開けてビーズがちょうど割れるまで（5 分以内）乾燥させます。

8. チューブを磁気スタンドから外して溶出させる DNAを溶出する

1)。製品のサイズを選択する必要がない場合は、21 μL ddH ₂ O を直接追加します。ボルテックスまたはピペッティングで 10 回上下させてよく混ぜます。室温で 5 分間インキュベートします。チューブを軽く回転させて、磁気スタンドに置きます。溶液が透明になったら (約 5 分)、磁気ビーズに触れないように注意しながら、上清 20 μL を新しい PCR チューブに移します。

2)生成物のサイズを選択する必要がある場合は、102 μL ddH ₂ O を直接追加します。ボルテックスまたはピペッティングで 10 回上下させてよく混ぜます。室温で 5 分間インキュベートします。チューブを軽く回転させて、磁気スタンドに置きます。溶液が透明になったら (約 5 分)、磁気ビーズに触れないように注意しながら、上清 100 μL を新しい PCR チューブに移します。

注意：精製した製品を保存する必要がある場合は、TE バッファーで溶出することができます。

アダプター連結DNAのサイズ選択

1. 準備: Hieff NGS ^TMを受験する DNA 選択ビーズを冷蔵庫から取り出し、室温で少なくとも 30 分間平衡化します。80% エタノールを新しく準備します。

2. ビーズを反転または頂点を合わせてよく混ぜます。

3.目標サイズに基づいて、表11に従って100μLの精製DNAテンプレートに最初のビーズを加え、ボルテックスまたはピペッティングで10回よく混ぜます。

表11ビーズベースのサイズ選択のための推奨ビーズ：DNA比

注: 表中の「×」は DNA サンプルの容量を示します。たとえば、ライブラリの挿入長が 250 bp でサンプル DNA の容量が 100 μL の場合、最初のソーティングで使用する磁気ビーズの容量は 0.7×100 μL = 70 μL、2 回目のソーティングで使用する磁気ビーズの容量は 0.20×100 μL = 20 μL です。表の推奨ビーズ容量は、アダプターが連結された DNA 用です。連結前にサイズ選択手順を実行する場合は、Hieff NGS ^TM DNA 選択ビーズ (カタログ番号 12601) の製造プロトコルを参照してください。

4. 室温で5分間放置します。

5.チューブを軽く回転させて、磁気スタンドに置きます。溶液が透明になったら (約 5 分)、上清を新しい PCR チューブに移します。

6.ステップ5のサンプルに2回目の選択ビーズを追加します。 表11に従って、少なくとも10回ボルテックスまたはピペッティングでよく混ぜます。

7. 室温で5分間放置します。

8. 軽く遠心分離して溶液を落とし、遠心管を磁気ラックに置きます。磁気ビーズが完全に吸着したら（約 5 分）、慎重に液体を取り除きます。

9. チューブを磁気スタンドに置き、 新しく調製した 80% エタノール 200 μL をチューブに直接加えます。室温で 30 秒間インキュベートし、液体を慎重に除去します。

10. 繰り返す ステップ9をもう一度。

11. チューブを磁気スタンドに置いたまま、キャップを開けてビーズがちょうど割れるまで（5 分以内）乾燥させます。

12. チューブを磁気スタンドから外して溶出させ、 21 μL ddH ₂ O を直接加えます。 ボルテックスまたはピペッティングでよく混ぜ、室温で 5 分間インキュベートします。(注: 精製した製品を保管する必要がある場合は、TE バッファーで溶出してください。) チューブを軽くスピンダウンし、液体が透明になるまで磁気スタンドに置きます (約 5 分)。ビーズに触れないように注意しながら、上清 20 μL を新しい PCR チューブに移します。

ステップ4 ライブラリの増幅

このステップでは、PCR 増幅によって精製またはサイズ選択された生成物を濃縮することができます。

1.表12 の試薬リストを解凍し、転倒混和してよく混ぜ、後で使用するために氷上に置いておきます。

2. 滅菌したPCRチューブで次の反応物を組み立てます。

表12 アダプター連結DNAPCR反応システム

[注記]: * 完全なアダプタを使用した場合、 Hieff NGS ^TM プライマーミックス (Yeasen Cat#1 2190 または Cat#12191 ) が必要です。不完全なアダプター (Cat#12412~Cat#12413、Cat#12 312 ~Cat#12 315 、Cat#13370~Cat#13371) を使用する場合は、キットの説明書を参照して、キットに付属のインデックスプライマーを使用して増幅してください。

3. ピペッティングまたは振盪によって穏やかに混合し、軽く遠心分離して溶液を落とします。

4. チューブをサーモサイクラーに入れ、表13 に従ってプログラムを設定して増幅を開始します。

表13 PCR増幅反応プログラム

ステップ5 増幅後のクリーンアップ/サイズ選択

きれいな 上段のステップは ステップ 3 . Hieff NGS ^TM DNA選択ビーズ（0.9×、ビーズ：DNA=0.9：1）を使用してPCR産物を精製します。サイズ選択が必要な場合は、 手順を参照してください。 3 .

ステップ6 最終ライブラリの品質管理

構築したライブラリの品質は、一般的に濃度とサイズ分布を測定することによって評価されます。詳細については、注6を参照してください。