Hifair™ V マルチプレックスワンステップRT-qPCRプローブキット（ UDG Plusは、RNA をテンプレートとするマルチプレックス定量 PCR キットです。実験の過程で、逆転写と定量 PCR を同じチューブ内で実行することで、実験操作が簡素化され、汚染のリスクが軽減されました。

このキットでは、耐熱性Hifair ^TM V逆転写酵素によって第一鎖cDNAが効率的に合成され、UNICON ^TM HotStart Taq DNAポリメラーゼによって定量的に増幅されます。キットには主に、最適化されたMPバッファー、酵素ミックスなどが含まれています。バッファー溶液にはすでにMg ²⁺とdNTPが含まれています。さらに、非特異的PCR増幅を効果的に抑制し、複数のqPCR反応の増幅効率を向上させる因子が追加されており、増幅効率を確保し、最大複数の増幅反応を実行できます。dUTP / UDGシステムが追加され、エアロゾル汚染のリスクを効果的に防止します。

特徴

高感度：慎重に最適化されたバッファーシステムにより、最大 250 コピー/mL の低濃度テンプレートの検出感度が向上します。

優れた安定性: 製品は 18 か月間のリアルタイム安定性テストに合格しました。

dUP/UDG 汚染防止システム： dUTP/UDG 汚染防止システムを導入し、製品のエアロゾル汚染を効率的に低減し、偽陽性を減らし、正確な結果を確保します。

高速プログラムをサポート: 高速プログラムと互換性があり、40 分で結果が得られます。

コンポーネント

注: 1 ) 2×Hifair ^TM V MP バッファー の略語です Hifair ^TM V マルチプレックス ワンステップ RT-qPCR プローブ バッファーには、 dNTP、dUTP、Mg 2+ 、安定剤、エンハンサーなどが含まれています。

2) Hifair ^TM V 酵素ミックスには、主に耐熱性 Hifair ^TM V 逆転写酵素、UNICON TM HotStart Taq DNA ポリメラーゼ、 UDGase が含まれています。

ストレージ

彼は 製品 すべき なれ 保存された で -25℃〜-15℃ のために 18ヶ月。

説明書

反応組成

注意：使用前に必ずよく混ぜ、激しい振動による過度の泡立ちを避けてください。

a) プライマー/プローブ濃度:プライマー マルチプレックスプライマーを含むミックス。状況に応じて、最適なプライマー濃度は 0.1 ～ 1.0 μM です。異なる蛍光基を標識するマルチプレックスプローブを含むプローブミックス。状況に応じて、最適なプローブ濃度は 0.05 ～ 0.5 μMです。

c) テンプレートの希釈: qPCR は非常に感度が高いため、テンプレートを希釈することをお勧めします。コントロール Ct 値は 20 ～ 35 が適切です。

d)システムの準備: フィルターエレメントを外します。交差汚染とエアロゾル汚染を避けてください。

最適化されたサイクリングプロトコル

注： a)逆転写：温度は42 ℃または50 ℃で10〜15分選択できます。

b) 増幅反応：設計されたプライマーのTm値に応じて温度を調整します。

c)蛍光信号の取得：機器マニュアルの要件に従って実験手順を設定してください。

3.応用 装置

Rox搭載機器： ABI 5700、7000、7300、7700、7900HT Fast、StepOne™、StepOne Plus™

Low Rox搭載機器： ABI 7500、7500 Fast、ViiA™7、QuantStudio™ 3および5、QuantStudio™ 6、7、12k Flex

ストラタジェン MX3000P™、MX3005P™、MX4000P™

ロックスなしの装備：

Bio-Ra d CFX96™、CFX384™、iCycler iQ™、iQ™5、MyiQ™、MiniOpticon™、Opticon®、Opticon® 2、Chromo4™

エッペンドルフマスターサイクラー® ep realplex、realplex 2 s、キアゲンコルベット ロータージーン® Q、ロータージーン® 3000、ロータージーン® 6000

ロシュ・アプライド・サイエンスライトサイクラー® 480、ライトサイクラー® 2.0、ライトサイクラー® 96

サーモサイエンティフィック ピコリアル サイクラー、セフェイドスマートサイクラー®、イルミナエコ qPCR

注記

健康と安全を確保するために、白衣や手袋などの必要な個人用保護具を着用してください。

実験にはRNaseフリーの消耗品を使用してください。

感度テスト

-20°Cで18か月間保存した13650（実験群）と保存期間内の13650（対照群）を同時に、ORF遺伝子とN遺伝子を標的とした擬似ウイルスSARS-CoV-2の勾配希釈（500コピー/ml、250コピー/ml）で検査しました。各濃度で8つの複製ウェルを検査し、検出率は100％でした。また、増幅曲線のピーク形状とCt値に有意差はありませんでした。

リアルタイム安定性テスト

13650 は -20°C で 18 か月間保存され、有効期限内のものも含まれています。両グループで、SARS-CoV-2 擬似ウイルス ORF 遺伝子と N 遺伝子を 1000 コピー/ml の濃度で 20 個のウェルに同時に検査しました。検出率は両方とも 100% で、増幅曲線の形状や Ct 値に大きな違いはありませんでした。

図1. 赤：賞味期限内の13650個、青： -20℃で18か月間保存した13650個。

凍結融解サイクルを繰り返しても安定した性能

13650 試薬をドライアイスを使用して 30 回および 50 回の凍結融解サイクルにかけ、通常 -20°C で保存した試薬と並行して SARS-CoV-2 擬似ウイルス ORF 遺伝子を同時にテストしたところ、50 回の凍結融解サイクル後も 13650 試薬の性能は影響を受けないことが示されました。

図2. 赤：-20℃で通常保存した13650。紫： 13650を30回の凍結融解サイクル、緑： 13650を50回の凍結融解サイクル。

標準プロトコルおよび高速プロトコルに対応

13650ESを使用して、SARS-CoV-2擬似ウイルスのORF遺伝子とN遺伝子を、標準プロトコルと迅速プロトコルの両方で同じ反応システムで検出しました。結果は、4プレックスシステムでは、2つのプロトコル間で増幅曲線のピーク形状とCt値に違いがないことを示しました。

ドキュメント:

マニュアル