Taq DNAポリメラーゼの非特異的増幅はPCR実験でよく見られる問題で、検出結果の解釈に直接影響し、増幅感度の低下、さらには標的断片の収量の低下につながる可能性があります。酵素修飾子を利用してTaq DNAポリメラーゼの活性中心を室温で密封し、それによってTaq酵素のDNAポリメラーゼ活性を室温で阻害することが、現在、非特異的増幅を抑制する最も効果的な方法です。Yishengが開発したデュアルシール抗体は、Taq DNAポリメラーゼのポリメラーゼ活性を密封するだけでなく、同時にTaq DNAポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ活性も密封します。このデュアルアプローチは、ミスペアリングやプライマーダイマーによる非特異的増幅を効果的に防止し、材料の劣化による非特異的シグナルの発生も防止し、試薬の特異性を二重に高めます。これにより、検出試薬は輸送や室温での使用に容易に対応できます。

1.極めて高い増幅特異性 - 二重シール抗体はポリメラーゼとエキソヌクレアーゼの両方の活性を同時にシールできるため、非特異的増幅を効果的に回避し、特異性を高めることができます。

2.優れた検出感度 - ホットスタート方式により、低存在量の遺伝子を効果的に検出し、より高い感度を実現します。

3.優れた製品安定性 - 37°C で 5 日間、または 4°C で 10 日間置いても性能が安定します。

4.ベースラインの安定性と優れた直線性 - ベースラインのドリフトの問題に対処し、優れた直線性を実現します。

5.酵素活性の急速な放出 - 95°C で 20 秒間加熱することで、95% を超える酵素活性を放出できます。

6.酵素の幅広い適用性 - 野生型と変異型の両方の Taq 酵素に適しており、抗体 1 mg あたり 4 ～ 10 KU の Taq 酵素を封入できます。

1 Taq DNAポリメラーゼエキソヌクレアーゼ活性の阻害

合成プライマープローブを、シールされていない、または二重閉鎖抗体でシールされた Taq DNA ポリメラーゼの反応混合物にそれぞれ組み込み、反応を 40°C で実施しました。両方の蛍光シグナルが検出され、二重閉鎖抗体が Taq DNA ポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ活性を効果的にシールできることが分かりました。

図 2. 二重シール抗体エンドヌクレアーゼ活性のシール効率の検出。

02 検出感度検証

Yeasenの二重密封抗体とT社の抗体をそれぞれ使用してTaq酵素を密封し、ARMS-PCR技術で陽性サンプルを検出したところ、Yeasenの二重密封抗体で密封されたTaq酵素は、ARMS-PCR増幅においてより高感度で正確であることがわかりました。

赤:YEASEN抗体+Taq 、青:サプライヤーA抗体+Taq 。

図3. ARMS-PCRの増幅曲線。

03 安定性検証（4℃で10日間、37℃で5日間）。

従来のクローズド抗体とダブルクローズド抗体を使用してそれぞれ Taq DNA ポリメラーゼをブロックし、ポリメラーゼをプライマーとプローブを含む完全なプレミックス溶液に配合します。この溶液を 4°C で 10 日間、または 37°C で 1、3、5 日間放置し、ASF プラスミドの 10,000 コピーを増幅します。増幅曲線と Ct 値に大きな変化は見られませんでした。

図 4. Taq ポリメラーゼを従来のブロッキング抗体 (A) と二重ブロック抗体 (B) でブロックした後、qPCR システムで増幅した 10,000 コピーの ASF プラスミドの増幅曲線。 

04 ベースライン検出

特定のプライマーを特定のバッファーおよび機器と組み合わせて使用​​する特定の条件下では、ベースライン ドリフトと呼ばれる現象が発生する場合があります。ただし、ダブルクローズド抗体を使用すると、ベースライン ドリフトの問題を効果的に解決できるため、より安定したベースラインを実現できます。

図5. qPCR分析におけるSARS-CoV-2 N遺伝子（A）とACT遺伝子（B）の増幅曲線。

05 直線性検証

二重閉鎖抗体で密封された反応混合物を使用して、ASFV/ACT デュアルプラスミドの 100,000、10,000、1,000、および 100 コピーを増幅し、標準曲線を作成しました。図 7 からわかるように、両方とも良好な直線性を示しています。

図 6. 二重ブロック反応混合物を使用して生成された ASFV 遺伝子と ACT 遺伝子の標準曲線グラフ。

06 酵素活性放出アッセイ

Yeasen 社の二重閉鎖抗体 (カタログ番号 31303) を使用して Taq 酵素を密封し、95°C で 20 秒間熱ショックを与えて酵素活性を検出しました。95°C で 20 秒間の熱ショックの後、31303 は酵素活性の 95% 以上を放出できることが観察され、これは T 社の抗体に匹敵します。

表 1. 酵素の 95°C で 20 秒間の熱ショック。

07 マルチプレックス Taq ポリメラーゼ検出

Yeasenの二重閉鎖抗体（カタログ番号31303）を使用して、3種類のTaqポリメラーゼ（野生型+ 2つの変異型）を1μg対5Uの密封比で密封し、蛍光値と密封効率を測定しました。さまざまなタイプのTaqポリメラーゼに対して、Yeasenの二重閉鎖抗体（カタログ番号31303）は優れた密封効果を示すことがわかりました。

表 2. さまざまなタイプの Taq ポリメラーゼの阻害効率。