説明
Cell Counting Kit-8 (CCK-8) は、WST-8 (2-(2-メトキシ-4-ニトロフェニル)-3-(4-ニトロフェニル)-5-(2,4-ジスルホフェニル)-2H-テトラゾリウム一ナトリウム塩) 試薬に基づく高速で高感度の検出キットです。WST-8 は MTT のアップグレード試薬で、ミトコンドリアの脱水素酵素によって水溶性の高いオレンジ黄色のフォルマザンに還元されます。生成されるフォルマザンの量は、生細胞の数に比例します。マイクロプレートリーダーで検出された 450nm でのフォルマザンの OD 値は、生細胞の数を間接的に示すことができます。このキットは、薬物スクリーニング、細胞増殖および細胞毒性アッセイ、腫瘍薬物感受性試験、および生物学的因子の活性検出に広く使用されています。
CCK-8法の利点
1. CCK-8 法と他の細胞増殖/毒性検出法の比較。
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検出方法 |
MTT法 |
XTT方式 |
WST - 1つの方法 |
CCK 8法 |
|---|---|---|---|---|
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フォルマザン製品の水溶性 |
低い（有機溶媒を加えて溶解してからテストする必要がある） |
高い |
高い |
高い |
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製品の特徴 |
粉 |
溶液2本 |
解決 |
溶液1本 |
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使用方法 |
溶液に混ぜて使用する |
溶液は使用直前に調製されました。 |
箱から出して |
箱から出して |
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検出感度 |
高い |
非常に高い |
非常に高い |
高い |
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検出時間 |
長さ |
短い |
短い |
最短 |
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検出波長 |
560-600 nm |
420-480 nm |
420-480 nm |
430-490 nm |
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細胞毒性 |
高い毒性、細胞形態の完全な消失 |
毒性が低く、細胞形態は変化しない |
毒性が低く、細胞形態は変化しない |
毒性が低く、細胞形態は変化しない |
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試薬の安定性 |
一般的な |
低い |
一般的な |
高い |
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バルクサンプルテスト |
実現可能 |
適切な |
適切な |
適切な |
2. フェノールレッドと血清は CCK-8 の検出を妨げません。
3. CCK-8試薬の細胞毒性は非常に低いため、CCK-8試薬を添加した後、異なる時間にマイクロプレートリーダーで繰り返し読み取ることで、最適な測定時間を決定できます。
配送と保管
製品は乾燥した暗い場所で-25〜-15℃で2年間保存できます。
予防
1. 最初の実験では、播種する細胞の最適な数と CCK-8 試薬の最適なインキュベーション時間を決定することをお勧めします。
2. 可能であれば、マルチチャンネルピペットを使用して、複製ウェル間のばらつきを減らします。気泡は OD の読み取りに影響を及ぼすため、実験中に気泡が入らないようにしてください。CCK-8 試薬を追加するときは、培養培地に挿入するのではなく、培養プレートの壁の近くに追加することをお勧めします。
3. 白血球の場合はより長い培養時間が必要になる場合があります。
4. 標準の 96 ウェル プレートを使用する場合、播種する細胞数は少なくとも 1,000 個/ウェル (100 μL) です。白血球の検出感度は比較的低いため、少なくとも 2,500 個/ウェル (100 μL) を播種することをお勧めします。24 ウェルまたは 6 ウェル プレートを使用する場合は、各ウェルの対応する細胞数を計算し、適切な量の CCK-8 試薬を追加します (追加する CCK-8 試薬の量は、プレートの各ウェルの培養液の量の 10% です)。
5. 450 nm フィルターが利用できない場合は、430 ～ 490 nm の吸光度を持つフィルターを使用できますが、450 nm フィルターを使用すると最高の検出感度を実現できます。
6. 培地中のフェノールレッドの吸光度はブランク群の吸光度を差し引くことで除去できるため、フェノールレッドは測定に影響を与えません。
7. 安全と健康のため、実験を行うときは白衣と使い捨て手袋を着用してください。
説明書
I. 標準曲線を作成する
1. 細胞懸濁液を調製し、細胞密度を決定し、細胞を播種します。
2. 細胞を培養培地で一定の比率（1:2 比率など）に従って順次希釈し、細胞濃度勾配を形成します。通常、細胞濃度勾配は 3 ～ 5 個で、各濃度ごとにウェルを 3 ～ 6 回繰り返します。
3. 播種後、細胞を接着させるために2～4時間培養します。その後、CCK-8試薬を加え、一定時間培養し、OD値を測定します。細胞数をX軸、OD値をY軸として標準曲線をプロットします。この標準曲線に従って、未知のサンプル中の細胞数を判定できます（この標準曲線を使用する前提は、実験条件が一貫していることです）。
II. 細胞生存率アッセイ
1. 96 ウェル プレートに細胞 (100 μL/ウェル) を播種します。プレートをインキュベーター (37°C、5% CO 2 ) に一定時間置き、プレインキュベーションを行います。
2. 各ウェルに CCK-8 試薬 10 μL を加え (ウェルに気泡が入らないように注意してください。気泡は OD の読み取りに影響します)、軽く混ぜます。
3. プレートをインキュベーターに入れて1〜4時間インキュベートします。
4. マイクロプレートリーダーで450 nmの吸光度を測定します。
5. OD 値をすぐに測定しない場合は、各ウェルに 0.1 M HCl 溶液または 1% w/v SDS 溶液を 10 μL 加え、プレートを覆い、遮光して室温で保管します。吸光度値は 24 時間以内に変化しません。
III. 細胞増殖および細胞毒性試験
1. 96 ウェル プレートに細胞 (100 μL/ウェル) を播種します。プレートをインキュベーター (37°C、5% CO 2 ) に 24 時間置いてプレインキュベーションします。
2. 試験対象物質の異なる濃度を 10 μL ずつプレートに加えます。
3. プレートをインキュベーターに入れて、一定時間（6、12、24、48 時間など）インキュベートします。
4. 各ウェルに CCK-8 試薬 10 μL を加え (ウェルに気泡が入らないように注意してください。気泡があると OD の読み取りに影響します)、軽く混ぜます。
5. プレートをインキュベーターに入れて1〜4時間インキュベートします。
6. マイクロプレートリーダーで450 nmの吸光度を測定します。
7. OD 値をすぐに測定しない場合は、各ウェルに 0.1 M HCl 溶液または 1% w/v SDS 溶液を 10 μL 加え、プレートを覆い、遮光して室温で保管します。吸光度値は 24 時間以内に変化しません。
注意：物質が酸化性または還元性である場合、CCK-8試薬を添加する前に、古い培地を新しい培地に交換し（古い培地を取り除き、細胞を新しい培地で2回洗浄し、新しい培地を追加します）、物質の影響を排除します。物質自体が吸光度値にわずかな影響しか与えない場合は、培地を交換する必要はなく、物質を含むブランクグループの吸光度値を差し引くことで、物質の影響を排除できます。
計算式
細胞生存率 = [(AC) /(BC)] x100%
阻害率 = [(BA) /(BC)] x100%
A: 実験群の吸光度（細胞、CCK-8試薬、試験対象物質を含む培地の吸光度）
B: 対照群の吸光度（細胞を含む培養液、CCK-8試薬の吸光度）
C: ブランク群の吸光度（CCK-8試薬を含む培地の吸光度）
引用
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