Annexin V-EGFP/PI 細胞アポトーシス検出キットは、EGFP 標識 Annexin V をプローブとして使用し、初期細胞アポトーシスの発生を検出します。
検出原理は、通常の生細胞ではホスファチジルセリン（PS）は細胞膜の内側にありますが、早期アポトーシス細胞ではPSが細胞膜の内側から細胞膜の表面に反転し、細胞外環境に露出しています。アネキシンVは、PSに高い親和性で結合する分子量35～36kDaのCa2 ⁺依存性リン脂質結合タンパク質です。ホスファチジルセリンは、細胞の外側に露出したホスファチジルセリンを介して、早期アポトーシス細胞の膜に結合することができます。
さらに、生存している初期細胞を壊死細胞または後期アポトーシス細胞と区別するために、ヨウ化プロピジウム (PI) が提供されます。PI は核酸染料であり、正常細胞または初期ア​​ポトーシス細胞の無傷の細胞膜を通過できませんが、後期アポトーシス細胞および壊死細胞の細胞膜を通過して核を赤くします。したがって、アネキシン V を PI と組み合わせると、PI は生細胞 (アネキシン V ^- /PI ^- ) および初期アポトーシス細胞 (アネキシン V ⁺ /PI ^- ) から排除されます。後期アポトーシス細胞および壊死細胞は、EGFP と PI の両方に対して二重陽性でした (アネキシン V ⁺ /PI ⁺ )。
このキットはフローサイトメトリーおよび蛍光顕微鏡に適しています。

製品構成

配送と保管

コンポーネントはアイスパックとともに出荷され、光の当たらない場所で -20°C で保管でき、凍結と解凍の繰り返しは 1 年間避けてください。
【注意事項】：短期間に繰り返し使用する必要がある場合は、4℃で遮光して半年間保存できます。

注意事項

1) アポトーシスは急速なプロセスであるため、サンプルは染色後 1 時間以内に分析することをお勧めします。
2) 接着細胞の場合、消化は重要なステップです。EDTA は Annexin V の PS への結合に影響を与える可能性があるため、消化溶液に EDTA を使用しないでください。
3) アポトーシスと細胞周期を同時に検出するなどの目的で細胞を固定する場合は、アネキシン V-FITC を使用してください。アネキシン V-EGFP は使用しないでください。固定中に EGFP が変性し、蛍光を励起する能力が失われるためです。細胞は固定前にアネキシン V-FITC とともにインキュベートされ、結合していないアネキシン V-FITC は結合バッファーで洗い流されます。固定中に細胞透過性が増加すると、アネキシン V に結合して結果に干渉する可能性のある細胞残骸が生じるためです。
4) サンプルが血液である場合は、必ず血液から血小板を除去してください。血小板にはアネキシン V に結合して結果に影響を及ぼす可能性のある PS が含まれているためです。血小板は、EDTA を含む緩衝剤を使用して 200 g で遠心分離することで洗い流すことができます。
5) カバーを開ける前に試薬を軽く遠心分離し、カバーを開けたときに液体が飛び散らないように、カバーの内壁の液体をチューブの底に捨ててください。
6) Annexin V-EGFPおよびPIは光に敏感な物質ですので、操作中は光を避けてください。
7) 研究目的のみにご使用ください。

説明書

実験設計
ブランクチューブ: Annexin V-EGFP および PI 染色溶液を含まないネガティブコントロール細胞を電圧調節に使用しました。
単一染色チューブ: Annexin V-EGFP のみを添加した陽性対照細胞を使用して補償を調整しました。
検出チューブ: 細胞はアネキシン V-EGFP と PI 染色溶液で処理されました。実験データは、ブランクチューブと単一染色チューブのパラメータを調整することによって取得されました。
1.1 サンプル染色
1) 懸濁細胞：細胞を4℃で5分間300gで遠心分離して回収した。
接着細胞: EDTA を含まないトリプシンで消化した後、4 ° C で 300 g で 5 分間遠心分離して細胞を採取しました。偽陽性を防ぐために、トリプシン消化時間は長すぎないようにする必要があります。
2) 細胞を予め冷却したPBSで2回洗浄し、毎回300 gで洗浄後、4℃で5分間遠心分離した。
3) 細胞を1×結合バッファーで再懸濁し、濃度を1～5×106/mLに調整した。
4) 100 μL の細胞懸濁液を 5 mL フローサイトメトリーチューブに加え、5 μL の Annexin V-EGFP を加え、細胞を混合して光の下で室温で 5 分間インキュベートしました。
5) 10μlのPI溶液と400μlのPBSを加え、すぐに染色を行った。
[注意]：フローサイトメトリーを使用してアポトーシスを検出する場合、PI は時間に大きく影響され、時間が長すぎると PI 染色が増加するため、フローサイトメトリーは 1 時間以内に完了する必要があります。
1.2 フローサイトメトリー分析
EGFPの最大励起波長は488 nm、最大発光波長は507 nmでした。PI-DNA複合体の最大励起波長は535 nm、最大発光波長は615 nmでした。解析にはCellQuestなどのソフトウェアを使用し、EGFPを横軸、PIを縦軸とした2色ドットプロットを描きました。サンプルごとに10,000イベントを収集します。典型的な実験では、細胞を3つのサブグループに分けることができ、生細胞は非常に低強度の背景蛍光のみを持ち、初期アポトーシス細胞は強い緑色蛍光のみを持ち、後期アポトーシス細胞は緑色と赤色の蛍光の二重染色を持ちます。