アネキシンV-Alexa Fluor488/PIアポトーシス検出キットの検出原理は、通常の生細胞ではホスファチジルセリン（PS）は細胞膜の内側にありますが、早期アポトーシス細胞ではPSが細胞膜の内側から細胞膜の表面に反転し、細胞外環境に露出しています。アネキシンVは、分子量35〜36KDのCa2 ⁺依存性リン脂質結合タンパク質であり、PSに高い親和性で結合し、細胞の外側に露出したホスファチジルセリンを介して早期アポトーシス細胞の細胞膜に結合します。
さらに、生存している初期細胞を壊死細胞または後期アポトーシス細胞と区別するために、ヨウ化プロピジウム (PI) が提供されます。PI は核酸染料であり、正常細胞または初期ア​​ポトーシス細胞の無傷の細胞膜を通過できませんが、後期アポトーシス細胞および壊死細胞の細胞膜を通過して核を赤くします。したがって、Annexin V を PI と組み合わせると、PI は生細胞 (Annexin V ^- /PI ^- ) および初期アポトーシス細胞 (Annexin V ⁺ /PI ^- ) から排除されました。対照的に、後期アポトーシス細胞および壊死細胞は、Alexa Fluor488 および PI に対して二重陽性でした (Annexin V ⁺ /PI ⁺ )。

製品構成

配送と保管

コンポーネントはアイスパックとともに出荷され、-20°C で 1 年間保管できます。

注意事項

1) アポトーシスは急速なプロセスであるため、サンプルは染色後 1 時間以内に分析することをお勧めします。
2) 接着細胞の場合、消化は重要なステップです。EDTA は Annexin V の PS への結合に影響を与える可能性があるため、消化溶液に EDTA を使用しないでください。
3) サンプルが血液である場合は、血液から血小板を必ず取り除いてください。血小板にはアネキシン V に結合して結果に影響を及ぼす可能性のある PS が含まれているためです。EDTA を含む緩衝剤を使用して、200 g で遠心分離して血小板を洗い流すことができます。
4) カバーを開ける前に試薬を軽く遠心分離し、カバーを開けたときに液体が飛び散らないように、カバーの内壁の液体をチューブの底に捨ててください。
5) Annexin V-Alexa Fluor488 および PI は感光性物質であるため、取り扱い時には光を避けて保管する必要があります。
6) 研究目的のみにご使用ください。

説明書

1.1 サンプル染色
1.a) 懸濁細胞: 細胞を4℃で5分間300gで遠心分離して収集した。
b) 接着細胞: EDTA を含まないトリプシンで消化した後、4 °C で 5 分間、300 g で遠心分離して細胞を採取しました。偽陽性を防ぐために、トリプシン消化時間は長すぎないようにする必要があります。
2. 細胞を4℃に予冷したPBSで2回洗浄し、毎回300gで遠心し、4℃で5分間遠心分離した。
3. 細胞に250μLの1×結合バッファーを加えて再懸濁し、濃度を1×106/mLに調整した。
4. 100 μLの細胞懸濁液を5mLフローサイトメトリーチューブに加え、5μLのAnnexin V-Alexa Fluor 488と10μLのPIを加え、穏やかに混合しました。
5. 反応物を光から遠ざけ、室温で15分間放置した。
6. 1×結合バッファー400μLを加えて混合し、1時間以内にフローサイトメトリーでサンプルを検出しました。
[注記]: 細胞洗浄中に細胞が失われるのを防ぐため、小さなチップを使用して液体を吸引することができます。
1.2 フローサイトメトリー分析
Alexa Fluor488 の最大励起波長は 488 nm、最大発光波長は 519 nm です。PI-DNA 複合体の最大励起波長は 535 nm、最大発光波長は 615 nm でした。CellQuest などのソフトウェアを使用して解析し、Alexa Fluor488 を横軸、PI を縦軸とする 2 色ドット プロットを描画しました。サンプルごとに 10,000 件のイベントを収集します。
1.3 蛍光顕微鏡分析
1) Annexin V-FITC/PI で二重染色した細胞懸濁液をスライド上に一滴垂らし、カバーガラスで細胞を覆います。
2) 2色フィルター付き蛍光顕微鏡で観察したところ、Annexin V-FITCの蛍光シグナルは緑色、PIの蛍光シグナルは赤色でした。