細胞がアポトーシスを起こすと、ヌクレオソーム間のゲノム DNA を切断するエンドヌクレアーゼ酵素が活性化されます。アポトーシス中に DNA が抽出されると、180～200 bp の DNA ラダーが見つかります。
TUNEL (TdT 媒介 dUTP ニックエンドラベリング) アポトーシス検出キット (Alexa Fluor 640) は、組織細胞の後期アポトーシス過程における核 DNA 断片化を検出するために使用できます。原理は、末端デオキシヌクレオチド転移酵素 (TdT) の作用により、Alexa Fluor 640-12-DUTP がゲノム DNA 切断中に露出した 3´-ヒドロキシル (3´-OH) 末端に組み込まれることです。したがって、蛍光顕微鏡またはフローサイトメトリーで検出できます。Alexa Fluor 640 は、安定性が高く、輝度が強い赤色蛍光染料です。
このキットは幅広い用途があり、凍結切片やパラフィン切片、培養された接着細胞や懸濁細胞におけるアポトーシスの検出に使用できます。

製品構成

配送と保管

コンポーネントはアイスパックとともに出荷され、-20°C で 1 年間保管できます。

注意事項

1. 細胞洗浄用の PBS、錠剤を密封するための抗蛍光消光液、固定用の 4% パラホルムアルデヒドをご自身で準備する必要があります。白血球は長期間培養する必要がある場合があります。
2. 研究目的のみにご使用ください。

説明書

1. サンプルの準備
1.1 パラフィン包埋組織切片
1.1.1.パラフィン組織切片を室温でキシレンに5分間浸し、これをさらに1回繰り返してパラフィンを完全に除去した。
1.1.2.切片を100%エタノールに室温で5分間浸し、これをもう一度繰り返します。
1.1.3.室温で、サンプルを勾配エタノール（90、80、70％）に各3分間浸した。
1.1.4. 切片をPBSで軽くすすぎ、ろ紙でスライドガラス上のサンプルの周りの余分な液体を慎重に拭き取ります。この場合、パラフィンペンまたは疎水性ペンを使用してサンプルの周囲にサンプル分布の輪郭を描くことができ、下流の透過性処理およびバランスラベリング操作に便利です。実験中にサンプルを乾燥させないでください。処理したサンプルをウェットボックスに入れて、サンプルを湿らせておきます。
1.1.5.2 mg/mLプロテイナーゼK溶液をPBSで1:100の割合で希釈し、最終濃度20μg/mLとした。
1.1.6.各サンプルに20μg/mLの濃度のプロテイナーゼK溶液100μLを加えて完全に覆い、室温で20分間インキュベートした。
[注]：プロテイナーゼKは、組織や細胞が後続のステップで染色試薬に対して透過性になるのを助けます。インキュベーション時間が長すぎると、後続の洗浄ステップで組織切片がキャリアプレートから落ちるリスクが高まり、インキュベーション時間が短すぎると透過性処理が不十分になり、標識効率に影響する可能性があります。より良い結果を得るには、プロテイナーゼKのインキュベーション時間を最適化する必要がある場合があります。
1.1.7.サンプルをPBS溶液で2〜3回すすぎ、余分な液体を丁寧に取り除き、スライド上のサンプルの周りの液体をろ紙で丁寧に拭き取ります。処理したサンプルは、サンプルの湿気を保つためにウェットボックスに入れます。
1.2 組織の凍結切片
1.2.1. 凍結切片を取り出し、室温に戻します。スライドを 4% パラホルムアルデヒド溶液 (PBS に溶解) に浸し、固定して室温で 30 分間インキュベートします。
1.2.2. 余分な液体を静かに取り除き、ろ紙を使用してスライドガラス上のサンプルの周りの余分な液体を慎重に吸い取ります。
1.2.3. スライドをPBS溶液に浸し、室温で15分間インキュベートし、再度PBSで合計2回洗浄した。
1.2.4. 余分な液体を静かに取り除き、ろ紙でスライドガラスを慎重に拭き取り、サンプルの周りの余分な液体を取り除きます。この場合、パラフィンペンまたは疎水性ペンを使用して、サンプルの周囲にサンプル分布の輪郭を描くことができます。これは、下流の透過処理とバランスラベリング操作に便利です。実験中は、サンプルを乾燥させないようにし、処理したサンプルをウェットボックスに入れて、サンプルを湿らせた状態に保ちます。
1.2.5. 2 mg/mLプロテイナーゼK溶液をPBSで1:100の割合で希釈し、最終濃度20 μg/mLとした。
1.2.6. 各サンプルに20μg/mLの濃度のプロテアーゼK溶液100μLを加えて完全に覆い、室温で10分間インキュベートした。
[注記]: プロテイナーゼ K は、組織や細胞が後続のステップで染色試薬を透過できるようにします。インキュベーション時間が長すぎると、後続の洗浄ステップで組織切片がキャリアプレートから落ちるリスクが高まり、インキュベーション時間が短すぎると透過処理が不十分になり、標識効率に影響する可能性があります。より良い結果が得られない場合は、プロテイナーゼ K のインキュベーション時間を最適化する必要がある場合があります。
1.2.7. PBS溶液が入ったオープンビーカーでサンプルを2〜3回すすいでください。
[注意]：洗浄段階でサンプルが剥がれて失われるのを防ぐため、ボトルを洗浄するのではなく、スライドガラスをPBS溶液に2〜3回浸して洗浄することをお勧めします。
1.2.8. 余分な液体を丁寧に取り除き、ろ紙を使用してスライド上のサンプルの周りの液体を慎重に吸い取ります。処理したサンプルは、サンプルの水分を保つためにウェットボックスに入れます。
1.3 セルクロールシートの作成
接着細胞はLab-Tekチャンバースライド上で培養されました。アポトーシス誘導処理後、スライドはPBSで2回洗浄されました。
1.4 細胞塗抹標本の作製（ポリリジンコーティングスライドを例に）
1.4.1. 細胞をPBSに約2×107細胞/mLの濃度で再懸濁し、細胞懸濁液50～100μLをポリリジンでコーティングしたスライド上に吸引し、細胞懸濁液を清潔なスライドで静かに広げた。
1.4.2. 細胞を固定し、スライドをPBS中の4%の新しく調製したパラホルムアルデヒドを含む染色タンクに浸し、4℃で25分間置いた。
1.4.3. スライドを洗浄し、PBS に浸し、室温で 5 分間放置します。PBS で再度洗浄します。
1.4.4. 余分な液体を静かに取り除き、ろ紙でスライドガラスを慎重に拭き取り、サンプルの周りの余分な液体を取り除きます。この場合、パラフィンペンまたは疎水性ペンを使用して、サンプルの周りのサンプルの分布の輪郭を描き、下流の透過性処理とバランスラベリング操作を容易にすることができます。実験中は、サンプルを乾燥させないようにし、処理したサンプルをウェットボックスに入れて、サンプルを湿らせておきます。
1.4.5. 2 mg/mLプロテイナーゼK溶液をPBSで1:100の割合で希釈し、最終濃度20 μg/mLとした。
1.4.6. 各サンプルに20μg/mLの濃度のプロテイナーゼK溶液100μLを加えて完全に覆い、室温で5分間インキュベートした（透過処理のために、PBSで調製した0.2％トリトンX-100溶液に浸し、室温で5分間インキュベートすることもできる）。
[注記]: プロテイナーゼ K は、組織や細胞が後続のステップで染色試薬を透過できるようにします。インキュベーション時間が長すぎると、後続の洗浄ステップで組織切片がキャリアプレートから落ちるリスクが高まり、インキュベーション時間が短すぎると透過処理が不十分になり、標識効率に影響する可能性があります。より良い結果が得られない場合は、プロテイナーゼ K のインキュベーション時間を最適化する必要がある場合があります。
1.4.7. サンプルを PBS で 2 ～ 3 回すすぎ、余分な液体を丁寧に取り除き、スライド上のサンプルの周りの液体をろ紙で丁寧に拭き取ります。処理したサンプルはウェット ボックスに入れます。
2. 陽性コントロールのDNase処理手順
サンプル浸透後、細胞を DNase I で処理して陽性対照スライドを準備します。通常、このプロセスにより、処理された細胞のほとんどが緑色の蛍光を発します。
[注記]: 固定化細胞をDnase I処理すると染色体DNAが切断され、標識可能なDNAの3'末端が多数生成されます。
2.1. 10×DNase I バッファーを脱イオン水で 1:10 の割合で希釈します (サンプルごとに 1×DNase I バッファー 200 µL が必要、つまり希釈には 10×DNase I バッファー 20 µL と脱イオン水 180 µL が必要です)。100 µL を透過性サンプルに滴下し、室温で 5 分間インキュベートします。残りの 100 µL の 1×DNase I バッファーに 1 µL の DNase I (1U/µL) を加えて、最終濃度を 10 U/mL にします。
2.2. 液体を静かに除去し、10 U/mL DNase Iを含む緩衝液100 μLを加え、室温で10分間インキュベートした。
2.3.スライドを軽くたたいて余分な液体を取り除き、脱イオン水の入った染色タンクでスライドを3〜4回徹底的に洗浄します。
[注意]: 陽性コントロールスライドには別の染色タンクを使用する必要があります。そうしないと、陽性コントロールスライドに残留した DNase I によって実験スライドのバックグラウンドが高くなる可能性があります。
3. ラベル付けと検出
3.1. 平衡化バッファー（5 x 平衡化バッファー）を脱イオン水で 1:5 の割合で希釈します（サンプルごとに 100 μL の 1 x 平衡化バッファーが必要です）。
3.2. 各サンプルに平衡化バッファー (100 μL 1×平衡化バッファー) を加えて完全に平衡化し、室温で 10 ～ 30 分間インキュベートしました。または、スライドがサンプルを平衡化しないように、1 x 平衡化バッファーの入ったバットにスライドさせます。Alexa Fluor 640-12-dUTP ラベリング ミックスを氷上で細胞のバランスを取りながら解凍し、表 1 に従ってすべての実験とオプションの陽性コントロール反応に十分な TdT インキュベーション バッファーを準備します。面積が 5 cm2 未満の標準反応の場合、容量は 50 μL であり、50 μL に実験反応と陽性コントロール反応の数を掛けて、必要な TdT インキュベーション バッファーの合計容量を決定します。表面積が大きいサンプルの場合、試薬の容量を比例して増やすことができます。

表1. 実験およびオプションの陽性対照反応用に調製したTdTインキュベーションバッファー

[ネガティブコントロールシステム]：TdT酵素を含まないコントロールインキュベーションバッファーを調製し、TdT酵素をddH2Oに置き換えた。
3.3. 平衡化領域の周囲にある 100 μL の 1×平衡化バッファーの大部分を吸収紙で洗い流し、次に 50 μL の LTdT インキュベーションバッファーを 5 cm2 の細胞領域に加えます。細胞を乾燥させないでください。その後、スライドを遮光する必要があります。
3.4. 試薬が均一に分散されるように、細胞の上にプラスチックのカバーガラスを置き、ウェットボックスの底に水で湿らせたペーパータオルを置きます。スライドをウェットボックスに入れ、37°C​​で60分間インキュベートします。ウェットボックスをアルミホイルで包み、光から保護します。
[注意]: プラスチックカバーガラスは使用前に半分に切ることができます。カバーガラスの端を折り曲げると、簡単に取り外して操作できます。
3.5. プラスチックカバーガラスを取り除き、切片をPBS溶液中で室温で5分間インキュベートし、その後切片を新鮮なPBSで2回洗浄した。
3.6. ろ紙を使ってサンプルの周囲と裏側の PBS 溶液を軽く拭き取ります。
[注]: バックグラウンドを減らすために、スライドを PBS で 1 回洗浄した後、0.1% Triton X-100 と 5 mg/mL BSA を含む PBS で 5 分間ずつ 3 回洗浄すると、未反応のマーカーが透明できれいになります。
3.7. サンプルは染色タンクで染色し、スライドは暗所で PI 溶液 (1 μg/mL、新しく調製し PBS で希釈) を含む染色タンクに浸し、室温で 5 分間放置しました。 (オプション) : サンプルは染色タンクで染色し、スライドは暗所で DAPI 溶液 (2 μg/mL、新しく調製し PBS で希釈) を含む染色タンクに浸し、室温で 5 分間放置しました。
3.8. サンプルを洗浄し、スライドを脱イオン水に浸して室温で 5 分間放置します。これを 2 回繰り返して、合計 3 回の洗浄を行います。
3.9. スライド上の余分な水分を拭き取り、サンプルの湿潤状態を保つために 100 μl の PBS をサンプル領域に追加しました。
3.10. サンプルはすぐに蛍光顕微鏡で分析され、Alexa Fluor 640 の赤色蛍光が 620 nm で検出され、青色 DAPI が 460 nm で観察されました。DAPI はアポトーシス細胞と非アポトーシス細胞の両方を青色に染色することができ、アポトーシス核にのみ Alexa Fluor 640-12-dUTP が組み込まれ、赤色蛍光が局在していました。必要に応じて、スライドを暗所で 4 °C で一晩保存できます。
4. 浮遊細胞はフローサイトメトリーによって検出された
4.1. 3～5×106個の細胞を4℃で遠心分離（300×g）してPBSで2回洗浄し、4℃で10分間300gで遠心分離した後、0.5mLのPBSに再懸濁した。
4.2. 細胞を固定し、PBSで調製した1％パラホルムアルデヒド溶液5mLを加え、氷上に20分間置いた。
4.3. 細胞を4℃で10分間300×gで遠心分離し、上清を除去して5mLのPBSに再懸濁した。洗浄を1回繰り返し、細胞を0.5mLのPBSに再懸濁した。
4.4. 細胞を透過させ、氷冷した70%エタノール5mLを加え、-20℃で4時間インキュベートした。細胞は70%エタノール中で-20℃で1週間保存することも、PBSで調製した0.2% Triton X-100溶液で細胞を透過させ、室温で5分間保存することもできる。
4.5. 細胞を300×gで10分間遠心分離し、5mLのPBSに再懸濁した。遠心分離を繰り返し、1mLのPBSに再懸濁した。
4.6. 2×106個の細胞を1.5mlのマイクロ遠心チューブに移します。
4.7. 平衡化を300×gで10分間遠心分離し、上清を除去して80μLの1×平衡化バッファーで再懸濁した。室温で5分間インキュベートする。
4.8. 細胞のバランスを取りながら、Alexa Fluor 640-12-dUTP ラベリング ミックスを氷上で溶かし、表 1 に従ってすべての反応に十分な量の TdT インキュベーション バッファーを調製しました。2 × 106 細胞の標準反応の場合、容量は 50 μL であり、50 μL に反応数を掛けて、必要な TdT インキュベーション バッファーの総量を決定しました。
4.9. 細胞を300×gで10分間遠心分離し、上清を除去し、沈殿物を50μLのTdTインキュベーションバッファーに再懸濁し、遮光下で37℃で60分間インキュベートした。細胞は15分ごとにマイクロピペットで穏やかに再懸濁した。
4.10. 20 mM EDTA 1 mLを加え、マイクロピペットで穏やかに混合して反応を停止した。
4.11. 300gで10分間遠心分離した後、上清を捨て、沈殿物をPBSで調製した5mg/mL BSAを含む1mLの0.1% Triton X-100溶液に再懸濁した。溶液を1回繰り返し、合計2回洗浄した。
4.12. 細胞をフローサイトメトリーで分析し、Alexa Fluor 640赤色蛍光を620 nmで測定した。