説明書

1. 実験前の準備

1）実験で使用する必要な試薬や材料を準備します。

2）qPCR装置の適合性を確認する

このキットは、以下のタイプの qPCR 機器で使用できます。

1. バイオ・ラッド: CFX96
2. サーモサイエンティフィック：7500 リアルタイム PCR システム；QuantStudio™5；
3. 実験方法

1） DNA抽出

DNA抽出には「磁気残留DNAサンプル調製キット」（手動抽出の場合はCat#18461ES、自動抽出の場合はCat#18462ES）の使用をお勧めします。詳細については、「http:/www.yeasenbiotech.com」をご覧ください。

詳細情報と購入。

キット（カタログ番号40619ES）には内部コントロール（IC）が含まれています。DNA抽出前にサンプルにICを加えると、完全なプロセス（DNA抽出とqPCR反応を含む）を検証できます。qPCRマスターミックスにICを加えると、

直接使用する場合、IC は qPCR コントロールとしてのみ機能します。

2）qPCRミックスの調製

1. 陽性コントロール（PCS）、テンプレートなしコントロール（NTC）、陰性コントロール溶液（NCS）、テストサンプル（TS）を含むサンプル量に応じて、反応回数を計算します。2つの反応を並行して準備します。

各サンプルは一般的に。

* PCS：陽性コントロール溶液；NTC：テンプレートなしコントロール；NCS：陰性コントロール溶液；TS：試験サンプル。実施する必要はありません。

PCS と NTC のサンプル抽出は可能ですが、NCS と TS は必要です。

反応ウェル（M1）=（1×NCS + N×TS） ×2

反応ウェル（M2）=（1×PCS + 1×NTC） ×2

反応ウェル（M3）=（1×PCS + 1×NTC+ N×TS） ×2

1. 実験計画と以下の表に従って、必要な量の試薬を氷上で事前に解凍します。
2. 反応回数に応じてqPCRミックスの量を計算します。キットを製品リリースなどのGMP活動に使用する場合は、表1と2を使用して準備することをお勧めします。キットを研究のみに使用し、評価後の抽出前にICを追加する必要がない場合は、表3に従ってください。

準備。M1、M2、M3 のすべてを準備する必要はないことに注意してください。

表1 M1用qPCRミックスシステム

*表1の構成システムは、NCSとTSの両方で抽出前にICを追加することを前提としているため、

qPCRミックス調製時にICを追加します。抽出前のIC添加方法：まず、DNA希釈液でICを20倍に希釈し、1μLを加えます。

さらなる抽出のために、希釈した IC を各 100μL のテストサンプルに添加します。

**このキットにはROXリファレンスダイは含まれていません。現在使用しているリアルタイムPCRアンプにROXリファレンスダイが必要な場合は、50×ROXリファレンスダイ（カタログ番号10200ES）の使用をお勧めします。この場合、追加量は表1に示すように0.8μLです。他のものを使用する場合は、

ROX 製品のブランドについては、ROX の添加に関する説明書を参照してください。ROX 参照色素が不要な場合は、添加量は 0 μL です。

表2 M2用qPCRミックスシステム

*表2の構成システムは、抽出前にPCSとNTCにICが添加されていないことを前提としているため、qPCR Mixの調製中にICを添加する必要があります。抽出後のIC添加方法：DNA希釈液でICを100倍に希釈し、希釈したIC 1μLをqPCR Mixに添加します。

各qPCRミックスシステム。

**このキットにはROXリファレンスダイは含まれていません。現在使用しているリアルタイムPCRアンプにROXリファレンスダイが必要な場合は、50×ROXリファレンスダイ（カタログ番号10200ES）の使用をお勧めします。この場合、追加量は表1に示すように0.8μLです。他のものを使用する場合は、

ROX 製品のブランドについては、ROX の添加に関する説明書を参照してください。ROX 参照色素が不要な場合は、添加量は 0 μL です。

表3 M3用qPCRミックスシステム

*表3の構成システムは、抽出前にサンプルにICを添加しないことを前提としているため、qPCR Mixの調製中にICを添加する必要があります。抽出後のIC添加方法：DNA希釈液でICを100倍に希釈し、各qPCR Mixに1μL添加します。

システム。

**このキットにはROXリファレンスダイは含まれていません。現在使用しているリアルタイムPCRアンプにROXリファレンスダイが必要な場合は、50×ROXリファレンスダイ（カタログ番号10200ES）の使用をお勧めします。この場合、追加量は表1に示すように0.8μLです。他のものを使用する場合は、

ROX 製品のブランドについては、ROX の添加に関する説明書を参照してください。ROX 参照色素が不要な場合は、添加量は 0 μL です。

3）テンプレートの追加

1. qPCRミックスを十分に振って混ぜ、低速で遠心分離し、キャップから残留液を回収します。

チューブの底まで。

1. 各反応チューブ/ウェルに20μLのqPCRミックスを加えます。各反応チューブ/ウェルに対応するqPCRミックスを加えることに注意してください。

サンプルチューブを使用してエラーの追加を回避します。

1. qPCR ミックスが入ったチューブ/ウェルにテンプレートを追加します。テンプレートの追加については、表 4 を参照してください。

表4 テンプレートの追加

*DNA抽出用のNCSのテンプレートとしてDNA希釈バッファー（40619-E）を使用することをお勧めします。

**各チューブ/ウェルの総反応容量は40 μLです。

***チューブの蓋またはプレートフィルムを覆います。蛍光信号の読み取りに影響を与えないように、チューブの蓋やフィルムに跡が付かないように注意してください。

または、スクレーパーでフィルムを繰り返しこすります。

****テンプレートを加えた後、反応チューブまたはプレートを低速で短時間遠心分離します。十分に振とうして混合した後、遠心分離を繰り返します。

低速で蓋や壁から底に液体を集めます。操作中に泡が出ないようにしてください。ミックスが

よく混ざっていないので、このステップは良い実験結果を得るために非常に重要です。

4）qPCRプログラムの設定

1. プログラムファイル設定

例 (7500 リアルタイム PCR システム機器とリアルタイム PCR ソフトウェア v2.4):

機器タイプ：7500 (96ウェル)

実験タイプ：定量-標準曲線；

化学：Taqman®試薬

ランプ速度：標準（1回の走行に約2時間）

1. ターゲットチャネル設定

「プレート設定」の「ターゲットとサンプルの定義」で、ターゲット 1 チャネル (FAM) を作成し、レポート蛍光グループとして FAM を選択し、消光蛍光グループとして MGB またはなしを選択します。ターゲット 2 チャネル (VIC) を作成し、レポート蛍光グループとして VIC を選択し、消光蛍光グループとしてなしを選択します。「プレート設定」の「ターゲットとサンプルの割り当て」で、追加の ROX 色素が追加されていない場合は「なし」を選択します。追加の ROX が追加されている場合は、

ロックス。

1. 標準増幅プログラム設定

表5 標準増幅プログラム設定

1. ベースラインとしきい値の設定:

ベースライン調整の原則：通常は自動ベースラインを使用します。手動で調整する必要がある場合は、指数関数的増殖期の前のサイクルを開始サイクルとして選択し、初期蛍光収集の変動ゾーンを避けます。最も早い指数関数的増幅サンプルのCtの1〜2サイクル前のサイクルを終了サイクルとして選択します。

終点。

閾値調整の原則：通常は自動閾値を使用します。手動で調整する必要がある場合は、閾値をネガティブサンプルまたはベースラインノイズよりも高く設定する必要があります。通常は、閾値を後半に設定します。

指数関数的増幅の段階では、各トンネルごとに相対的に独立した適切な閾値が必要です。

5）結果分析

1. PCS、NTC、NCSの結果判定:

ICが追加された場合：各コントロールサンプルの仕様は表6を満たす必要があります。

表6 PCS、NTC、NCSの結果判定

ICを添加していない場合：各品質管理サンプルは表6のFAM信号列の仕様を満たし、

VIC チャネルを分析する必要があります。

1. TSの結果判定

前提条件: TS結果の分析の前に、PCS、NTC、NCSが表6の仕様を満たしているかどうかを判断する必要があります。合格した場合は、次のステップに進むことができます。合格しなかった場合、TS結果は信頼できない可能性があり、

その理由を調査する必要がある。

ICが追加された場合: 表7のFAMとVICの結果情報に従って対応する結果判定を見つけます。

表7: TSの結果判定（IC追加）

*VIC 信号に阻害がある場合は、阻害因子を除去するための処置、またはテストを繰り返す必要があります。

ICが追加されていない場合：表8のFAMの結果情報に従って対応する結果判定を見つけ、VIC信号を分析する必要はありません。

表8: TSの結果判定（IC未添加）

注記

1. このキットを使用する前に、このマニュアルをよくお読みください。サンプルの取り扱い、反応システムの準備、サンプルの添加など、実験は標準化された方法で行う必要があります。

2. 可能であれば、サンプルの追加と試薬の準備の操作は氷上で行ってください。
3. 使用前に各試薬をボルテックスしてよく混ぜてください。

4. 安全のため、白衣と使い捨て手袋を着用して作業してください。
5. この製品は研究目的にのみご使用いただけます。