Vero 宿主細胞 DNA 残留物検出キットは、さまざまな生物学的製品の中間サンプル、半製品、完成品中の Vero 宿主細胞 DNA 残留物の定量分析に使用されます。

このキットは、Taqman 蛍光プローブとポリメラーゼ連鎖反応 (PCR) 法を採用しており、fg レベルの最小検出限界を持ち、残留 Vero 細胞 DNA を特異的かつ迅速に検出できます。このキットは、残留 DNA サンプル調製キット (カタログ番号 18461ES) と一緒に使用する必要があります。

製品構成

^* IC：内部統制

配送と保管

1. ドライアイスで輸送し、-20℃で2年間保管

2.商品を受け取ったら、すぐに確認し、対応する保管温度で保管してください。

注意事項

1. この試薬を使用する前にこのマニュアルをよく読み、サンプルの取り扱い、反応システムの準備、サンプルの添加など、実験を標準化する必要があります。

2. サンプルの追加と溶液の調製は氷上で行うのが最適です。

3. 使用前に各成分が完全にボルテックスされ、低速で遠心分離されていることを確認します。

4. 安全と健康のため、操作時には白衣と使い捨て手袋を着用してください。

5. この製品は研究目的にのみご使用ください。

適用可能な機器モデル

以下を含みますが、これらに限定されません:

Bio-Rad: CFX96 光学モジュール。

Thermo Scientific: ABI 7500、ABI Quant Studio 5、ABI Step OnePlus。

使用説明書

1. Vero DNA標準液の希釈と標準曲線の作成

Vero DNA コントロールは、キットに付属の DNA 希釈バッファーを使用して勾配希釈され、希釈濃度は 300 pg/μL、30 pg/μL、3 pg/μL、300 fg/μL、30 fg/μL、3 fg/μL です。

詳細な手順は以下を参照してください。

1.1 Vero DNA コントロールと DNA 希釈バッファーを氷上で解凍します。完全に解凍したら、軽くボルテックスして混ぜ、低速で 10 秒間遠心分離します。

1.2 3 ng/μL、①、②、③、④、⑤、⑥と印を付けた6本の清潔な1.5mLチューブを取り出します。

1.3 90 μL の DNA 希釈バッファーと 10 μL の Vero DNA コントロールを 3 ng/μL と表示された 1.5 mL マイクロチューブに加え、3 ng/μL に希釈します。混合してから 10 秒間遠心分離します。希釈した DNA 標準を小分けし、-80°C で短期間 (3 か月以内) 保存できます。凍結融解を繰り返さないでください。

1.4 他のチューブに 90 μL の DNA 希釈バッファーを加え、以下の手順に従って連続希釈を行います。

[注記]:

1. 各濃度ごとに 3 つの複製ウェルが必要です。検出範囲は 3 fg/μL ～ 300pg/μL で、必要に応じてこの範囲を拡大できます。

2. 凍結融解の繰り返し回数を減らし、汚染を防ぐために、DNA コントロールを最初は小分けにして -80°C で保存することをお勧めします。

3. 解凍した DNA 希釈バッファーは 2 ～ 8 °C で 7 日間保存できますが、長期間使用しない場合は -20 °C で保存してください。

4. テンプレートが完全に混合されていることを確認し、各勾配希釈ごとに混合物を 15 秒から 1 分間軽く振ってください。

2. 抽出回収制御（ERC）の準備

必要に応じて、ERC 内の Vero DNA の濃度を次のように設定します (ERC サンプルは、例として 3 pg/μL DNA で準備されました)。

2.1 100μLの試験サンプルを清潔な1.5mLチューブに加え、10μLの3pg/μL Vero DNA標準（③）を加えてよく混ぜ、ERCとマークします。

2.2 ERCサンプルのDNA抽出をテストサンプルと一緒に実行し、精製されたERCサンプルを調製します。

3. 陽性コントロールサンプル（PCS）の準備（オプション）

必要に応じて、PCS 内の Vero DNA の濃度を次のように設定します (例として、PCS は 3 pg/μL DNA で準備されました)。

3.1 3 pg/μL Vero DNA標準液（③）100μLを清潔な1.5mLチューブに加え、PCSとマークします。

3.2 試験サンプルとともにPCSのDNA抽出を行い、精製PCSを調製する。

4. ネガティブコントロール溶液（NCS）の調製

実験でネガティブコントロールを設定します。具体的な操作手順は次のとおりです。

4.1 100 μL のサンプル マトリックス (または DNA 希釈バッファー) を清潔な 1.5 mL チューブに追加し、NCS とマークします。

4.2 NCSサンプルと試験サンプルのDNA抽出を行い、精製NCSサンプルを調製します。

5. テンプレートコントロール（NTC）の準備なし

実験でテンプレートなしコントロールを設定する場合、具体的な操作手順は次のとおりです。

5.1 NTC はサンプルの前処理を必要とせず、残留 DNA 含有量の qPCR 検出の段階で設定できます。

5.2 各チューブまたはウェルの NTC サンプルは、20 μL ミックス (つまり、16 μL Vero qPCR ミックス + 4 μL Vero プライマー&プローブ ミックス) + 20 μL DNA 希釈バッファーです。3 つの複製ウェルを構成することをお勧めします。

6. PCR反応システム

[注記]:

1. PCR 反応の総量を反応数で計算します: qPCR Mix = (反応数 + 2) × (16 + 4) μL (2 つの反応ウェルの損失を含む)。実験では、各サンプルに対して 3 回以上の反復が推奨されます。

2. チューブにキャップをするかプレートを密封した後、反応チューブまたはプレートを低速で 10 秒間遠心分離します。 5 秒間十分に振とうして混合した後、遠心分離を繰り返して、蓋または壁から底に液体を集めます。 操作中に気泡が発生しないようにしてください。

推奨されるプレート設定については、下の表を参照してください。

プレートレイアウトには、1 NTC (テンプレートなしコントロール)、1 NCS (ネガティブコントロール溶液)、6 STD (6 つの標準濃度の標準曲線)、3 TS (テストサンプル)、3 ERC (抽出回収コントロール)、1 PCS (ポジティブコントロールサンプル) が含まれます。各サンプルには 3 つの複製ウェルがあります。

7. PCR 装置のセットアップガイドライン (2 ステップ方式)

以下の手順は、Thermo ABI 7500 qPCR 機器 (ソフトウェア バージョン 2.0) にのみ適用されます。別の機器を使用する場合は、該当する機器ガイドのセットアップ ガイドラインを参照してください。

7.1 新しい実験を生成し、絶対定量化またはユーザー定義のテンプレートを選択します。

7.2 「定義」インターフェースと「ターゲット」ペインで、ターゲットを追加して FAM という名前を付け、レポーターとして「FAM」、クエンチャーとして「なし」を選択します。

7.3 「サンプル」ペインで、すべてのサンプル情報を順番に追加します。次に、ウェルを選択し、それに応じてターゲットとサンプルを選択します。Vero DNA 標準のタスクを標準に設定し、数量列に 300000、30000、3000、300、30、3 (各ウェルの DNA 濃度の単位は fg/μL) の値を割り当て、ウェルにそれぞれ STD 1、STD 2、STD 3、STD 4、STD 5、STD 6 という名前を付けます。NTC のタスクを NTC に設定します。NCS、TS、ERC、および PCS を不明に設定し、上記のプレート レイアウトに従ってそれぞれ名前を付けます。次に、[次へ] をクリックします。

7.4 増幅プログラムを設定します。反応容量を 40 μL に設定します。

8. qPCR結果の分析

8.1 システムは、分析の増幅プロット パネルでしきい値を自動的に提供します。システムによって提供されるしきい値は、ベースラインに近すぎる場合があり、その結果、複製ウェル間の Ct に大きな差が生じます。しきい値を適切な位置に手動で調整し、分析をクリックすることができます。その後、最初にマルチコンポーネント プロットで増幅曲線が正常かどうかを確認できます。

8.2 [結果分析] タブで、標準曲線プロットを確認します。傾き、Y 切片、R2、効率の値を確認します。通常の標準曲線の場合、R²>0.99、90%≤Eff%≤110% です。

8.3 分析の「ウェル テーブルの表示」ペインでは、各サンプルの濃度が数量で表示されます。単位は fg/μL で、アッセイ レポートで単位を pg/μL または pg/mL に変換できます。

マニュアル