説明
活性酸素種アッセイキットは、細胞透過性試薬 2',7'-ジクロロフルオレセイン ジアセテート (DCFDA) を使用して、生細胞サンプル中の活性酸素種を定量的に評価します。親油性の非蛍光 DCFDA は、受動拡散とそれに続く脱アセチル化によって容易に細胞膜を通過します。脱アシル化生成物は、酸化剤感受性 2',7'-ジクロロフルオレセイン (DCHF) です。DCHF は後に ROS によって酸化され、DCF を形成します。DCF は蛍光性が高く、励起/発光波長 480 nm/525 nm の蛍光分光法またはフローサイトメトリーによって検出されます。複合混合物である Rosup は ROS 誘導剤であり、陽性対照として使用できます。
製品構成
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部品番号 |
コンポーネント |
量 |
ストレージ |
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50101-A |
DCFH-DA（10mM） |
100µL |
-20℃ |
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50101-B |
ロサップ（100 mM） |
1mL |
-20℃ |
配送と保管
このキットには氷袋が同梱されています。-20°C で光を避けて 1 年間保管してください。凍結と解凍を繰り返さないでください。
適用方法
1. 試薬の準備
DCFH-DA 溶液: 開封する前に低速で軽く遠心分離します。10 mM DCFH-DA を無血清培地で希釈して最終濃度 10 μM になるようにし、DCFH-DA 溶液を調製します。
[注記]: DCFH-DA はフェノールレッドを含まない培地で希釈することもできます。新しく調製した DCFH-DA 溶液を使用してください。希釈した DCFH-DA を長期間保存することは推奨されません。必要な DCFH-DA の正確な濃度は使用する細胞株によって異なりますが、一般的な開始範囲は 10 ～ 50 μM です。特定の細胞では、ネガティブ コントロール (DCFH-DA プローブなし) の蛍光が非常に強い場合は、DCFH-DA を 2 ～ 5 μM に希釈し、インキュベーション時間を適切に短縮します。
Rosup 溶液: 100 mM Rosup ストック溶液を無血清培地で希釈して、100 µM Rosup 作業溶液を調製します。通常、暗所で 37 ℃ で 30 分～ 4 時間 Rosup をインキュベートすると、ROS が大幅に増加します。
[注記]: Rosup のインキュベーション時間は細胞株の感受性によって異なります。たとえば、Hela の場合は 30 分、MRC5 の場合は 1.5 時間です。30 分以内に ROS の増加が見られない場合は、誘導時間または濃度を適切に増やすことができます。ROS の上昇が速すぎる場合は、誘導時間または濃度を適切に減らすことができます。
薬剤: 目的の薬剤を 10% FBS またはその他の適切な溶液を含む完全培地で所望の濃度に調製します。
2. 接着細胞に対する推奨プロトコル
a) 細胞の準備: 実験前日に標準細胞培養培地で接着細胞を培養し、実験時に細胞合流率が 70% に達するようにします。
b) 薬剤誘導: 培地を取り除きます。各ウェルに、事前に調製した血清を含まない希釈薬剤を重ね、暗所で 37°C で必要な時間インキュベートします。
c) (オプション) 陽性コントロール: 陽性コントロールウェルに、事前に調製した Rosup 溶液を塗り、暗所で 37°C で必要な時間インキュベートします。
[注]: 刺激時間が短い細胞（通常 2 時間以内）の場合は、最初にプローブをロードし、その後 Rosup または目的の薬剤を追加することもできます。
d) ROSプローブのロード：培地をすべて除去し、無血清培地で細胞を1〜2回洗浄します。各ウェルに、事前に調製したDCFH-DA溶液を注ぎます。暗所で37℃で30分間インキュベートします。
e) 培地を除去し、無血清培地で細胞を1～2回洗浄して遊離DCFH-DAを除去します。
3. 浮遊細胞に対する推奨プロトコル
a) 細胞の準備: 実験当日に懸濁細胞をウェルあたり約 1.5 × 105 個まで増殖させます。
b) 薬剤誘導: 遠心分離により円錐管に細胞を集め、事前に調製した血清を含まない希釈薬剤の適切な量に再懸濁し、暗所で 37°C で必要な時間インキュベートします。
c) (オプション) 陽性コントロール: 陽性コントロール細胞を事前に調製した Rosup 溶液に再懸濁し、暗所で 37°C で必要な時間インキュベートします。
d) ROS プローブのロード: 新しいチューブに集め、PBS で 2 回遠心分離して細胞を洗浄します。細胞密度が 1×106 ～ 2×107/mL になるように、事前に調製した DCFH-DA 溶液で細胞を再懸濁します。次に、暗所で 37℃ で 30 分間インキュベートします。プローブと細胞が完全に接触するように、3 ～ 5 分ごとにチューブを反転します。
[注意]: 細胞密度は、その後の検出方法に応じて調整する必要があります。たとえば、フローサイトメトリーの場合、1本のチューブ内の細胞数は104/mL未満または106/mLを超えてはなりません。
e) 細胞を回収し、無血清培地で2回遠心分離して洗浄し、遊離DCFH-DAを除去します。
4. 蛍光検出とデータ解析
蛍光顕微鏡測定: 蛍光顕微鏡を使用して、フルオレセイン (FITC) に適したフィルター セットで生細胞顕微鏡検査を実行します。細胞の明るさを視覚的に評価し、コントロールとサンプルを比較するか、画像分析法を使用して細胞のデジタル写真間の信号を比較します。
フローサイトメトリー測定: 接着細胞はトリプシンで収集し、単一細胞懸濁液を調製する必要があります。浮遊細胞の場合は、細胞を直接収集します。理想的には、実験条件ごとに 10,000 個の細胞を分析する必要があります。実験中は細胞が過度に密集しないようにする必要があります (<1 ×106 細胞/mL)。破片を除外し、ゲーティングで目的の細胞集団を分離します。平均蛍光強度を使用して、Ex/Em = 480/525 nm でコントロール サンプルと処理済みサンプル間の倍数変化を決定します。
蛍光マイクロプレート測定: 培地の存在下で、エンドポイント モードで蛍光プレート リーダーを使用して、Ex/Em = 480/525 nm でプレートを直ちに測定します。すべての測定値からブランクの読み取り値を差し引き、アッセイ コントロールからの倍数変化を決定します。
注意事項
1. バックグラウンドノイズを減らすために、DCFH-DA でインキュベートした後、細胞を洗浄します。
2. エラーを回避するために、インキュベーション後できるだけ早く蛍光を測定することをお勧めします。
3. 安全と健康のため、手術中は白衣と使い捨て手袋を着用してください。
4. 研究目的のみにご使用ください。
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