ピューロマイシンは、ストレプトマイセス・アルボニガーの発酵と代謝によって生成されるアミノグリコシド系抗生物質で、タンパク質合成を阻害することでグラム陽性菌、さまざまな動物細胞、昆虫細胞を殺します。ピューロマイシンは、場合によっては大腸菌に対して有効です。そのメカニズムは、ピューロマイシンがアミノイル-TrRNA分子の3'末端の類似体であり、リボソームのA部位に結合して延長ペプチド鎖に組み込まれるというものです。ピューロマイシンがA部位に結合すると、その後の反応には関与しなくなり、タンパク質合成が早期に終了し、C末端にピューロマイシンを含む未熟なポリペプチドが放出されます。

ピューロマイシン産生菌株 Streptomyces alboniger に見られる pac 遺伝子は、ピューロマイシン耐性を付与するピューロマイシン N-アセチルトランスフェラーゼ (PAC) をコードします。この特性は現在、pac 遺伝子プラスミドを持つ哺乳類の安定的にトランスフェクトされた細胞株をスクリーニングするために一般的に使用されています。

安定した細胞トランスフェクションの選択におけるピューロマイシンの一般的な応用は、レンチウイルスベクターの特性と関係があります。現在、市販のレンチウイルスベクターのほとんどは、pac 遺伝子を持っています。特定のケースでは、ピューロマイシンは、pac 遺伝子プラスミドを持つ大腸菌株の形質転換をスクリーニングするためにも使用できます。

この製品は細胞培養に適しており、一般的な使用濃度は 1 ～ 10 µg/mL です。

さらに、Yeasen 社は、状態は異なりますが同じ機能を持つ溶液形態のピューロマイシン (カタログ番号 60209ES) も提供しています。

特徴

純度≥ 98%

アプリケーション

細胞培養に適しています

pac遺伝子を持つプラスミドを持つ特定の哺乳類安定トランスフェクト細胞株をスクリーニングする

pac遺伝子プラスミドを持つ形質転換された大腸菌株をスクリーニングする

仕様

コンポーネント

配送と保管

ピュロマイシン塩酸塩製品は-15 ℃～-25℃で2年間保存してください。

説明書

1.推奨作業濃度

哺乳類細胞: 1-10 μg /mLの場合、最適濃度は殺菌曲線によって決定する必要があります。

大腸菌：LB寒天培地を用いて、125 μg /mLの濃度でpac遺伝子で安定的に形質転換された大腸菌をスクリーニングした。

注意：ピューロマイシンを使用した安定した大腸菌株のスクリーニングには、正確な pH 調整が必要です。

ピューロマイシン塩酸塩の推奨濃度

2. 溶解方法

ピューロマイシンを蒸留水に溶解し、50 mg/mLの保存溶液を調製します。0.22 μmのフィルター膜で濾過滅菌した後、小分けして-25～-15 ℃で保存します。または、メタノールに溶解して10 mg/mLの保存溶液を調製することもできます。

3.ピューロマイシン殺菌曲線の決定（shRNAトランスフェクションまたはレンチウイルストランスダクションを例に挙げる）

ピューロマイシンの有効なスクリーニング濃度は、細胞の種類、成長状態、細胞密度、細胞代謝、細胞周期の位置に関係します。安定的に発現する shRNA 細胞株をスクリーニングするには、トランスフェクトされていない/トランスデュースされた細胞を殺すピューロマイシンの最小濃度を決定することが重要です。初めて実験を行うお客様は、独自の実験システムに適した殺傷曲線を確立することをお勧めします。

1) 1日目: 24ウェルプレートに5 ～ 8 × 104細胞/ウェルの密度で播種し、その後の勾配実験のために十分な数のウェルに播種し、細胞を37 ℃で一晩インキュベートした。

2) 2日目: A) スクリーニング培地を準備します: 異なる濃度のピューロマイシンを含む新鮮な培地 (0-15 μg /mL、少なくとも5段階)。B) 一晩インキュベートした後、新しく準備したスクリーニング培地を細胞に交換します。その後、細胞を37 ℃でインキュベートします。

3) 4日目: 新しい選択培地に交換し、細胞の生存率を観察します。

4) 細胞の増殖状態に応じて、2〜3日ごとに新しい選択培地に交換します。

5) 抗生物質スクリーニング開始後 4 ～ 6 日以内に、トランスフェクトされていない細胞またはすべてのトランスフェクトされていない細胞を殺すのに効果的な薬剤の最低濃度を決定するために、細胞を毎日モニタリングして生存細胞の割合を観察しました。

4.安定的にトランスフェクトされた哺乳類細胞株のスクリーニング

pac 遺伝子を含むプラスミドを導入した後、細胞をピューロマイシンを含む培地で増殖させ、安定した導入体を選択した。

1) トランスフェクションの 48 時間後、細胞 (元の細胞または希釈した細胞) を適切な濃度のピューロマイシンを含む新鮮な培地で培養します。

注意: 抗生物質は細胞が活発に分裂しているときに最も効果を発揮します。細胞の密度が高すぎると、抗生物質の効果は大幅に低下します。細胞の密度が 25% を超えないように培養するのが最適です。

2)ピューロマイシンを含む培養培地を2～3日ごとに取り除き、交換します。

3) 細胞形成巣はスクリーニング後 7 日目に評価されます。病変は、宿主細胞株とトランスフェクション スクリーニングの効率に応じて、さらに 1 週​​間以上かかる場合があります。

注意: 細胞の増殖状態を毎日観察してください。ピューロマイシンのスクリーニングには少なくとも 48 時間必要であり、ピューロマイシンの有効濃度のスクリーニング期間は通常 3 ～ 10 日です。

4)耐性クローン 5～10 個を 35 mm ペトリ皿に移し、選択培地で 7 日間培養を続けます。この強化培養は、将来の細胞毒性実験に備えるためのものです。

ドキュメント:

安全データシート

60210 _MSDS_HB22042 1 _EN.pdf

マニュアル

60210 _マニュアル_HB2 5 011 4 _EN.pdf

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