G418 硫酸塩は、ジェネティシン硫酸塩とも呼ばれ、アミノグリコシド系抗生物質で、ゲンタマイシン B1 と構造的に類似しています。80 s リボソームに結合し、伸長段階を阻害することで、タンパク質合成を阻害します。G418 硫酸塩は、細菌、酵母、高等植物、哺乳類細胞、原生動物、線虫など、原核細胞と真核細胞の両方に毒性があります。トランスポゾン Tn601 (903) または Tn5 に位置する耐性遺伝子 (主に neo) は、細菌由来ですが、真核細胞で発現できます。耐性遺伝子は、遺伝子組み換え技術によって細胞に導入して G418 耐性を獲得することができ、耐性遺伝子を持つ原核細胞または真核細胞のスクリーニングと培養の維持に使用できます。

哺乳類細胞では、neo は真核生物ゲノムに組み込まれた後、アミノグリコシド 3' -ホスホトランスフェラーゼ (APH (3') II) の発現をコードします。この酵素は、G418 のアミノ基またはヒドロキシル基を共有結合的に修飾し、抗生物質とリボソームの相互作用を阻害することで抗生物質を不活性化し、細胞に G418 耐性を付与します。安定した細胞株のスクリーニング実験では、非耐性細胞を殺すための最小有効濃度を決定するために、殺菌曲線 (用量反応曲線) を確立する必要があります。

植物細胞では、nptII 遺伝子耐性プラスミドを導入することで耐性を獲得できます。nptII 遺伝子は、G418、カナマイシン、パロマイシンなどのいくつかの抗生物質を不活性化する酵素であるアミノグリコシドホスホトランスフェラーゼもコードします。

特徴

純度≥ 98%

工場大量生産方式による標準化生産

分子生物学や組織培養の生化学実験研究の分野で使用できる幅広い用途

協力プラットフォームは、

製品の品質安定性を確保するため、バッチ間の差は1%以内に管理されています。

アプリケーション

安定的にトランスフェクトされた細胞株のスクリーニング

仕様

コンポーネント

配送と保管

G418硫酸塩（ジェネティシン）製品は、-15℃ ～ -25℃ で3年間保存する必要があります。

説明書

1. G418保存溶液（50 mg/mL、有効濃度）の調製

1) 活動単位の変換

変換は次の式に従って行われた：（1000/A0）×A1=A2

A0: G418 の効力値はバッチごとに異なります。バッチ品質レポートまたはボトルのラベルを参照してください。

A1: 希望する活性G418の濃度。

A2: G418の実際の濃度。

例えば、バッチのG418活性値が750 U/mgで、G418の活性濃度が50 mg/mLの場合、実際に調製する粉末濃度は1000/750×50 mg/mL=66.67 mg/mLです。G418保存液（活性濃度50 mg/mL）を10mL調製する場合は、666.7 mgの粉末を計量する必要があります。

2) 殺菌と保存

上記の変換により得られた実際の粉末を量り、滅菌脱イオン水10mLを加えて完全に溶解します。

0.22 μmニードルフィルターを5 mLの滅菌脱イオン水で予め湿らせ、G418溶液を濾過滅菌します。滅菌したG418溶液を小分けし、-20℃で保存します。

注意：①濁った溶液を濾過しないでください。溶液は完全に溶解していないため、濾過プロセスによって薬剤が失われ、最終溶液の活性が低下します。②保存溶液を調製するために培地、リン酸溶液、または有機溶媒を使用することは推奨されません。

2.一般的に使用されるスクリーニング濃度

一般的に、トランスフォーマーのスクリーニングには最初に高濃度の G418 が必要であり、培養の維持には低濃度を使用します。成長条件、細胞の種類、その他の環境要因は G418 の有効投与量に影響を及ぼす可能性があるため、殺菌曲線 (用量反応曲線) を通じて最適なスクリーニング濃度を決定することをお勧めします。

一般的に、哺乳類細胞のスクリーニング範囲は 200 ～ 2000 μg/mL、植物細胞: 10 ～ 100 μg/mL、酵母細胞: 500 ～ 1000 μg/mL です。

細胞株実験データ

3.殺害曲線の確立

注: 標的タンパク質を安定して発現する細胞株をスクリーニングするには、トランスフェクトされていない宿主細胞を殺すことができる抗生物質の最小濃度を決定する必要があります。これは、殺傷曲線 (用量反応曲線) を確立することによって達成できます。少なくとも 6 つの濃度を選択する必要があります。G418 は有糸分裂細胞を処理するときに最も活性が高いため、G418 を追加する前に細胞を一定期間培養する必要があります。

1) 1日目: 形質転換されていない細胞を適切な培養プレートに置き、細胞密度20～25%で37℃で一晩CO2中で培養し_ます。

注: 生存率を検出するために高密度を必要とする細胞の場合は、接種量を増やすことができます。

2) 細胞の種類に応じて、適切な範囲内で G418 濃度勾配を設定します。哺乳類細胞の場合は、0、50、100、200、400、800、1000 μg/mL に設定できます。

3) 2 日目: 古い培地を取り除き、対応する濃度の薬剤を含む新しく調製した培地と交換します。濃度ごとに 3 つを並列に作成します。

4) その後、3〜4日ごとにG418を含む新鮮な培地と交換します。

5) 生細胞カウントは、適切な濃度を決定するために、固定サイクル（例：2 日ごと）で実行されます。安定したトランスフェクション細胞スクリーニングの作業濃度として、理想的な日数（通常 7 ～ 10 日）以内に大部分の細胞を殺す最小濃度を選択します。

4.安定導入細胞のスクリーニング

1) トランスフェクションの48時間後、適切な濃度のG418培養培地を使用して継代培養（直接継代培養または希釈継代培養）を行いました。

注意: 良好なスクリーニング結果を得るために、細胞を 25% 以下に希釈することをお勧めします。

2) 薬剤を含むスクリーニング培地を3～4日ごとに交換します。

3) スクリーニングの 7 日後に細胞コロニー形成を測定します。宿主細胞の種類、トランスフェクション、スクリーニングの有効性に応じて、コロニー形成にはさらに 1 週​​間以上かかる場合があります。

4) 耐性クローン5～10個を選択し、35mm細胞培養プレートに移し、薬剤を含むスクリーニング培地で7日間培養した。

5) 通常の培地と交換します。

ドキュメント:

安全データシート

60220 _MSDS_HB22042 1 _EN.pdf

マニュアル

60220 _マニュアル_HB2 5 011 5 _EN.pdf

数字

図1異なるバッチ間のゲノマイシンの有効濃度の安定性試験と検証

実験株: 大腸菌

G69とG99は2つの異なるバッチです

ゲノマイシンの使用濃度はそれぞれ8 mg/L、12 mg/L、16 mg/Lと判定され、有効最小濃度は雑菌の増殖を完全に抑制する16 mg/Lと判定されました。2つのバッチの性能は一貫していました。