説明
ストレプトマイセス・ハイグロスコピカスによって合成されるアミノグリコシド系抗生物質であるハイグロマイシン B は、70S リボソーム転座を妨害し、mRNA テンプレートの誤読を誘導することでタンパク質合成を阻害し、その結果、原核生物 (細菌など)、真核生物 (酵母、真菌など)、および高等哺乳類真核生物を死滅させます。
大腸菌由来のハイグロマイシン耐性遺伝子（hyg または hph）は、ハイグロマイシン B ホスホトランスフェラーゼをコードしており、この酵素はハイグロマイシン B を非生物学的に活性なリン酸化産物に解毒するため、ハイグロマイシン耐性遺伝子を導入した原核細胞または真核細胞のスクリーニングおよび培養に優れた選択マーカーとなります。また、作用機序が異なるため、ハイグロマイシン B は二重耐性細胞株の選択に G418 またはブラストサイジン S と組み合わせて使用されることがよくあります。ハイグロマイシン B は、ウイルス感染により膜透過性が高まった細胞に選択的に浸透し、翻訳を阻害するため、抗ウイルス剤としても使用できます。また、動物飼料に混ぜて虫除け剤としても使用できます。
さらに、Yeasen 社は、状態は異なりますが同じ機能を持つ溶液形態の Hygromycin B (カタログ番号 60224ES) も製造しています。
特徴
工場大量生産方式による標準化生産
アプリケーション
安定的にトランスフェクトされた細胞株のスクリーニング
仕様
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CAS番号 |
31282-04-9 |
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分子式 |
Ｃ ２０ Ｈ ３７ Ｎ ３ Ｏ １３ |
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分子量 |
527.52グラム/モル |
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純度 |
>90% (HPLC) |
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効力 |
≥ 1000単位/mg |
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構造 |
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コンポーネント
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コンポーネント番号 |
名前 |
60225ES03 |
60225ES10 |
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60225 |
ハイグロマイシンB |
1グラム |
10グラム |
配送と保管
ハイグロマイシンB製品は-15 ℃～ -25 ℃で2年間保存する必要があります。
説明書
1.原液（50 mg/mL）の調製
ハイグロマイシンBを0.5g量り取り、10mLの1 × PBS、pH7.4に加える。完全に溶解した後、0.22μmのフィルターで濾過して滅菌する。1回分（例えば1mL）ずつ小分けし、-25～-15 ℃で保存するか、 2 ～ 8 ℃ 。
2.一般的に使用されるスクリーニング濃度
安定した転移株をスクリーニングするために使用されるハイグロマイシン B の作業濃度は、細胞の種類、培地、成長条件、および細胞代謝率に応じて変える必要がありますが、推奨濃度は 50 ～ 1000 μg /mL です。最初の実験システムでは、最適なスクリーニング濃度を決定するために、殺菌曲線 (殺菌曲線)、つまり用量反応曲線が推奨されます。
一般的に、哺乳類細胞：50～500 μg /mL、細菌/植物細胞：20～200 μg /mL、真菌：300～1000 μg /mL。
3. 殺害曲線の確立
注: 安定した細胞株をスクリーニングするには、トランスフェクトされていない宿主細胞を殺すことができる抗生物質の最小濃度を決定する必要があります。これは、殺傷曲線 (用量反応曲線) を確立することによって達成できます。少なくとも 5 つの濃度を設定する必要があります。
1) 1日目: 形質転換されていない細胞を適切な培養プレートに20～25%の細胞密度で植え、一晩培養します。
注: 生命力を検出するためにより高い密度を必要とする細胞の場合、接種細胞の量を増やすことができます。
2) 細胞の種類に応じて適切な範囲内で濃度勾配を設定します。哺乳類細胞は、50、100、250、500、750、1000 μg /mL に設定できます。ハイグロマイシン B 溶液を脱イオン水または PBS バッファーで 1:10 に希釈して 5 mg/mL にします。次に、次の表に従って、溶液を対応する作業濃度に希釈します。
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最終濃度 ( μg /mL) |
培地量（mL） |
5 mg/mL ハイグロマイシンBの添加量（mL） |
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50 |
9.9 |
0.1 |
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100 |
9.8 |
0.2 |
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250 |
9.5 |
0.5 |
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500 |
9.0 |
1.0 |
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750 |
8.5 |
1.5 |
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1000 |
8.0 |
2.0 |
3) 2 日目: 対応する濃度の薬剤を含む新しく調製した培地と交換します。濃度ごとに 3 つのサンプルを並行して作成します。
4) その後、3〜4日ごとに薬剤を含む新鮮な培地と交換します。
5) 一定の間隔 (2 日ごとなど) で生細胞数をカウントし、トランスフェクトされていない細胞の増殖を阻害する適切な濃度を決定します。安定したトランスフェクタントの選択のための作業濃度として、理想的な日数 (通常 7 ～ 10 日) 以内に大部分の細胞を殺すことができる最低濃度を選択します。
4.安定的にトランスフェクトされた哺乳類細胞株のスクリーニング
1) トランスフェクションの48時間後、適切な濃度（直接または希釈）のハイグロマイシンBを含むスクリーニング培地で細胞を継代培養した。
注意: 抗生物質は活発に分裂する細胞に最もよく作用します。細胞が密集しすぎると、抗生物質は細胞を殺せません。細胞が 25% を超えないように細胞を分割します。
2) スクリーニング培地を3〜4日ごとに交換します。
3) スクリーニングの 7 日後に細胞コロニー形成を測定します。宿主細胞の種類、トランスフェクション、スクリーニングの有効性に応じて、コロニー形成にはさらに 1 週間以上かかる場合があります。
4) 耐性クローンを5～10個選んで35mm細胞培養プレートに移し、薬剤を含むスクリーニング培地で7日間培養します。
5) 培養のために薬剤を含まない新鮮な培地に交換します。
ドキュメント:
安全データシート
マニュアル
60225 _マニュアル_HB2 5 011 5 _EN.pdf
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