Diabetes mellitus (DM), een systemische chronische stofwisselingsziekte die wordt gekenmerkt door chronisch verhoogde bloedglucose veroorzaakt door een combinatie van meerdere ziektefactoren, is een wereldwijde gezondheidsepidemie en hangt samen met familiegenetica, omgevingsfactoren, en auto-immuniteit. Hoewel DM al millennia bekend is en er grote vooruitgang is geboekt in de diagnose en behandeling ervan, is er momenteel geen genezing voor de ziekte en worden de gevolgen voor de volksgezondheid alleen maar groter. Daarom is het met name belangrijk om een geschikt diermodel voor DM op te stellen en de pathogenese van DM en de complicaties ervan te verduidelijken. De meest gebruikte DM-diermodellen zijn chirurgische resectie van de pancreas, chemisch geïnduceerde diabetes, spontaan diabetesdiermodel en transgene dieren, etc.
Momenteel wordt het diabetesziektemodel geïnduceerd door Streptozotocine (STZ) wordt veel gebruikt, geschikt voor langetermijnobservatie. STZ is een nitrosoureaverbinding die, eenmaal in het lichaam, specifiek pancreas-β-cellen kan vernietigen via de volgende mechanismen:
(1) Injectie met hoge doses STZ kan de concentratie van intracellulair co-enzym I (NAD) in β-cellen doen afnemen en zo het NAD-afhankelijke energie- en eiwitmetabolisme remmen, wat resulteert in celdood;
(2) STZ verhoogt stikstofoxide (NO) productie, waarvan is aangetoond dat het bijdraagt aan β-celschade;
(3) Toegediend in een lage dosis kan STZ een auto-immuunproces veroorzaken dat leidt tot vernietiging van de β-cellen van de pancreaseilandjes: dode β-cellen kunnen, als gevolg van een lage dosis STZ, door macrofagen worden gefagocyteerd als antigenen om Th1-stimulerende factor te produceren, waardoor Th1-type lymfocyten dominant worden. Vervolgens produceren Th1-type lymfocyten IL-2 en IFN-γ, wat leidt tot infiltratie van ontstekingscellen in het eilandje en de afgifte van IL-1 en TNF-α, IFN-γ, NO en H2O2 om cellen te doden, wat uiteindelijk DM veroorzaakt.
1 Standaard SOP voor de constructie van het STZ-geïnduceerde diabetesmodel
1.1 Voorbereiding van dieren
Er is sprake van een opvallend seksueel dimorfisme en mannetjes zijn vatbaarder voor het ontwikkelen van diabetes. Omdat oestrogeen de werking van STZ verstoort, zijn vrouwtjes minder gevoelig voor de diabetogene werking van STZ dan mannetjes. Onderzoeken hebben aangetoond dat vrouwtjes een slechte modelleringsgraad en een hogere sterftecijfer hebben dan mannetjes, met name type I.
Type I-diabetes (T1DM): Ratten (170-200 g) en muizen (17-22 g) worden aanbevolen. Na een week van adaptieve voeding, vasten dieren gedurende 12 uur gevolgd door intraperitoneale injectie van STZ, wat gemakkelijk kan worden bediend en met een hoog succespercentage.
Type II-diabetes (T2DM):Ratten (leeftijd 4-5 weken, gewicht 90-100 g, bijv. SD of Wistar) en muizen (leeftijd 4-5 weken, gewicht 16-20 g, bijv. C57, ICR of Kunming) moeten gedurende 4-6 weken vóór toediening van STZ een dieet met veel vet en suiker krijgen. Het lichaamsgewicht kan individueel ongeveer 240-280 g en 30-35 g bedragen. SD wordt aanbevolen voor ratten en C57 voor muizen.
1.2 Diervoeding vóór STZ-toediening
Diabetes type 1: Geef alle muizen en ratten 1-2 weken voorafgaand aan de STZ-behandeling vrije toegang tot standaard knaagdiervoer en water.
Diabetes type 2: Consumptie van een dieet met veel vet en suiker om insulineresistentie te verhelpen voorafgaand aan de STZ-behandeling.
1.3 Bereiding van reagens
① Dieet met veel vet en suiker
Het dieet met veel vet en suiker wordt samengesteld door basisvoer voor ratten te mengen met sucrose, geraffineerd varkensvet en eigeelpoeder in de volgende massaverhouding: de verhoudingen zijn 10% varkensvet, 20% sucrose, 10% eigeelpoeder, 0,5% natriumcholaat en 59,5% basisvoer.
② STZ-natriumcitraatbuffer
Bereiding van oplossing A en oplossing B: weeg 2,1 g citroenzuur (molecuulgewicht: 210,14) af en los het op in 100 ml dubbel gedestilleerd water om oplossing A te maken; weeg 2,94 g natriumcitraat (molecuulgewicht: 294,10) af en los het op in 100 ml dubbel gedestilleerd water om oplossing B te maken.
Bereiding van natriumcitraatbuffer: Meng oplossingen A en B in een bepaalde verhouding (1:1,32 of 1:1), pas de pH aan tot 4,2-4,5 en steriliseer met een filter met een 0,22 μm filtermembraan. Dit levert de vereiste natriumcitraatbuffer op; het wordt aanbevolen om deze onmiddellijk te bereiden en te gebruiken.
Weeg het STZ-gevriesdroogde poeder, doe het in een droge, steriele fles, wikkel het in aluminiumfolie en zet het op ijs. Voeg voorgekoelde natriumcitraatbuffer (1% w/v) toe om op te lossen en steriliseer met een filter met een 0,22 μm filtermembraan.
【Opmerking】① Nadat het STZ-poeder uit de koelkast is gehaald, moet het ongeveer 10 minuten op kamertemperatuur en uit de buurt van licht worden bewaard totdat het volledig is ontdooid. ② Na het wegen moet de fles met het STZ-monster worden afgedekt met aluminiumfolie om het te beschermen tegen licht, omdat STZ instabiel is. ③ Los STZ niet in één keer op als u niet bedreven bent in injectie. Het wordt aanbevolen om STZ in groepen op te lossen volgens de operationele vaardigheid. Bereid STZ-oplossing voor één groep tegelijk voor, bijvoorbeeld 10 of 15 ratten/muizen per groep.
1.4 STZ-injectie
Dien de injectie intraperitoneaal of via de staartader toe op basis van het nuchtere gewicht van het dier. Vergeleken met intraperitoneale injectie heeft injectie via de staartader een hogere efficiëntie van het medicijngebruik, maar is technisch uitdagender. Als de injectietechniek niet bekwaam is, wissel dan tussen twee groepen voor de injectie en de injectie moet binnen 30 minuten voltooid zijn.
Diabetes type 1: Voor muizen wordt een enkele hoge dosis van 100-200 mg/kg aanbevolen, en meerdere lage doses van 20-50 mg/kg gedurende vijf opeenvolgende dagen. Voor ratten wordt een dosis van 40-70 mg/kg aanbevolen, toegediend in één injectie.
Diabetes type 2:Na een dieet met veel suiker en vet gedurende 1-2 maanden wordt bij muizen een dosis van 70-120 mg/kg aanbevolen, toegediend in één enkele injectie. Bij ratten is de aanbevolen dosis 25-40 mg/kg, toegediend in één enkele injectie.
【Opmerking】Het wordt aanbevolen om een pre-experiment uit te voeren om de juiste dosering van STZ te bepalen, vanwege verschillend gewicht, medicijntolerantie, vastentijd, injectiemethode en voedingsproces van proefdieren. Voer het experiment niet blindelings rechtstreeks uit volgens de dosering in de literatuur.
1.5 Na de injectie
Na de injectie van STZ, laat de dieren vrij om te drinken en eten. Vervang de vulling elke dag. Houd de kooi schoon en droog. Vermijd sterk zonlicht. Desinfecteer zo vaak mogelijk.
【Opmerking】Na STZ-injectie zal het bloedglucosegehalte van dieren drie fasen vertonen: voorbijgaande hyperglykemie (1-2 uur), voorbijgaande hypoglykemie (6-10 uur) en continue hyperglykemie (>72 uur). Insuline en glucose moeten op de juiste manier worden toegediend.
1.6 Remedie van diermodellering
Voor modellen die niet aan de criteria voldoen, kan STZ aanvullend worden toegediend zodra het dier is gestabiliseerd (met een intraperitoneale injectie in een dosis van 10-20 mg/kg, waarbij een geschikte dosis wordt gekozen op basis van de werkelijke situatie), of wachten tot de bloedglucosewaarden weer normaal zijn en dan injecteren met de routinematige dosis. Om het gewenste effect te bereiken, is het echter vaak nodig om het modelleringsproces opnieuw te starten nadat het dier weer in een normale staat is.
2 Evaluatie van STZ-geïnduceerde DM diermodellen
① Algemene kenmerken: gewichtsverlies, polydypsie, polyfagie en polyurie.
② Nuchtere bloedglucose (FGB), seruminsulinespiegel (FINS), orale glucosetolerantie (OGT), nuchtere seruminsuline (FSI) en insulinegevoeligheid.
③ Serum biochemische indexen: T-Cho, TG, HDL-C, LDL-C, CR, BUN, Alt, etc.
④ Pathologie van de pancreas: H&E-kleuring.
3 Mogelijke redenen voor het falen van het STZ-geïnduceerde DM-model
① Slechte kwaliteit van STZ. De zuiverheid van STZ voor modellering mag niet minder zijn dan 98% (HPLC-detectie).
② STZ-afbraak. STZ is een makkelijk te bevochtigen oplossing, moet droog worden gehouden om vocht te voorkomen. Het poeder vermijdt langdurige plaatsing bij kamertemperatuur, en de opgeloste STZ is zeer onstabiel, met een halfwaardetijd van neutrale pH van 15 min, en moet ter plekke worden gebruikt. Los de STZ op met een zure pH-waarde, bij voorkeur in een ijsbad.
③ STZ-oplossing werd in de darmen of andere organen geïnjecteerd.
Als het model niet voldoet aan de DM-standaard, wordt aanbevolen om nog eens 3 dagen te observeren. Als het model nog steeds niet voldoet, herhaal dan de injectieprocedure.
4 De oorzaken van de hoge sterfte onder dieren veroorzaakt door STZ
① Dieren zijn ondergewicht.
② Onvoldoende drinkwatervoorziening.
③ Hyperglycemie of hypoglycemie, meestal hyperglycemie. Dit kan worden verlicht door insuline-injectie of tijdelijke glucosesuppletie.
Insulinesupplementmethode: als bijvoorbeeld Novolin N of NPH (neutrale protamine zinkinsuline) elke keer 2-3 eenheden wordt gegeven, zal de algemene sterfte onder ratten na 3-5 dagen lager zijn.
Glucosesupplementmethode: Intraperitoneale injectie van 20% glucose 4 uur na STZ-injectie kan de dood van ratten door een lage bloedglucose als gevolg van vasten voorkomen.
④ Proefdieren doden elkaar door gebrek aan voedsel en water.
⑤ Infectie. DM-dieren zijn vatbaarder voor infecties dan andere, met name urineweginfecties en abdominale infecties, vanwege polyurie. Het is noodzakelijk om te desinfecteren voor en na invasieve operaties zoals intraperitoneale injectie, subcutane injectie en bloedafname. Bijvoorbeeld, tetracycline (of aureomycine oogzalf) kan worden aangebracht op de wond na elke bloedglucosemeting om infectie te voorkomen.
5 factoren die diabetesmodellering beïnvloeden
Factoren die het diabetesziektemodel beïnvloeden, zijn onder meer de kwaliteit van het STZ-modelleringsreagens, de conditie van de dieren en de toedieningsmethode. De belangrijkste prestatiekenmerken van het reagens zijn zuiverheid, stabiliteit en oplosbaarheid. De conditie van de dieren omvat voornamelijk genetische achtergrond, geslacht, gender, gewicht, broedomgeving en dieetstructuur. Toedieningsmethoden omvatten timing van toediening, intervallen tussen doses en toedieningsroutes. Gedifferentieerde factoren brengen gedifferentieerde modelleringseffecten teweeg.
6 Product Raanbeveling
| Productnaam | Kat# | Specificatie |
| 60256ES60 | 100mg | |
| 60256ES76 | 500mg | |
| 60256ES80 | 1 gram | |
| Citroenzuur, Monohydraat | 60347ES25 | 25 gram |
| Citroenzuur trinatriumzout, Dihydraat | 60348ES25 | 25 gram |
| Oplosmiddel voor Streptozocine STZ | 60750ES76 | 500 ml |
[1] Xi Z, et al. Dubbelgemodificeerde nanodeeltjes overwinnen de opeenvolgende absorptiebarrières bij orale insulinetoediening. J Control Release. 2022 feb;342:1-13. (PMID: 34864116, ALS:7.727)