Wat is Aureobasidine A
Aureobasidin A (AbA) is een cyclisch peptide antibioticum geïsoleerd uit de draadvormige schimmel Aureobasidium pullulans nr. R106, dat sterke antischimmel eigenschappen heeft en giftig kan zijn voor gist bij lage concentraties (0,1-0,5 μg/ml). Het werkingsmechanisme van AbA is via de remming van de activiteit van inositol fosforylceramide synthase (IPC synthase), een enzym gecodeerd door het AUR1 gen in gist, waardoor de synthese van ceramide naar inositol fosfolipiden wordt geblokkeerd, wat leidt tot een tekort aan sfingolipiden, breuk van het celmembraan en dus het doden van de stam. Schimmelsoorten die gevoelig zijn voor AbA omvatten Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Candida glabrata, Aspergillus nidulans en A. niger.
Figuur 1 Structuurformule van AbA, CAS#127785-64-2
Onderzoek heeft uitgewezen dat het AUR1-gen van Saccharomyces cerevisiae en het AURA-gen van Aspergillus nidulans homoloog zijn en beide coderen voor IPC-synthase. Mutaties in deze twee genen kunnen daarom sterke AbA-resistentie verlenen aan stammen, zoals het gemuteerde gen AUR1-C. AbA is zeer geschikt als een marker voor medicijnselectie voor het screenen van positieve klonen en vereist geen conditieoptimalisatie, met een zeer lage achtergrond. AbA-resistentie is ook een ideale reporter voor gist enkel/dubbel hybride studies en is compatibel met gist hybride systemen die overeenkomstige resistentie dragen.
Wat is het gist enkel/dubbel hybride systeem?
Het gist-twee-hybridesysteem (Gist-twee-hybridetest) werd gecreëerd door Fields en Song en anderen op basis van de kenmerken van eukaryotische transcriptionele regulatie. Het kan snel en direct de interacties tussen bekende eiwitten analyseren en wordt veel gebruikt in de studie van antigeen-antilichaaminteracties, de ontdekking van nieuwe eiwitten en nieuwe eiwitfuncties, het screenen op medicijndoelen en het vaststellen van genomische eiwitkoppelingskaarten. Het principe van gist-twee-hybride is dat de transcriptionele activator van eukaryoten twee verschillende structurele domeinen bevat: het DNA-bindende domein (DNA-bindend domein, DNA-BD) en het DNA-transcriptieactiveringsdomein (Activeringsdomein, AD), die onafhankelijk van elkaar kunnen worden gescheiden zonder elkaars functie te beïnvloeden. BD en AD alleen kunnen de transcriptionele respons niet activeren, alleen wanneer de twee ruimtelijk dicht genoeg bij elkaar liggen, vertonen ze de activiteit van een complete transcriptionele activator, waardoor het downstream-gen kan worden getranscribeerd. Door fusieplasmiden te construeren van de twee onderzochte eiwitten (eiwit X en proteïne Y) met respectievelijk BD- en AD-domeinen en deze in dezelfde gistcel tot expressie te brengen, wordt het reportergen niet getranscribeerd als er geen interactie is tussen de twee eiwitten. Als de twee eiwitten interacteren, liggen de BD- en AD-domeinen ruimtelijk dicht bij elkaar en wordt het reportergen getranscribeerd.
Figuur 2 Principediagram van gist-twee-hybride [1]
Yeast one-hybrid technology is een hulpmiddel voor het bestuderen van nucleïnezuur-eiwitinteracties, ontwikkeld op basis van yeast two-hybrid, en wordt veel gebruikt om de expressieregulatie van genen in eukaryotische cellen te bestuderen, zoals het identificeren of er een interactie is tussen bekend DNA en bekende eiwitten; het isoleren van nieuwe eiwitten die binden aan het beoogde cis-regulerende element of andere korte DNA-bindingsplaatsen; het nauwkeurig lokaliseren van de DNA-bindingsplaatsen waarvan is bewezen dat ze interacteren en het analyseren van de DNA-bindingsdomeinen van eiwitten. Het basisprincipe is om het bekende cis-werkende element stroomopwaarts van de meest basale promotor (minimale promotor, Pmin) te construeren en het reportergen stroomafwaarts van Pmin te verbinden. Het cDNA dat codeert voor de te testen transcriptiefactor wordt gefuseerd met de expressievector van het gist-AD-domein en in gistcellen geïntroduceerd.Als het product van dit gen zich aan het cis-element kan binden, kan het de Pmin-promotor activeren, waardoor het reportergen tot expressie kan komen.
Figuur 3 Principediagram van gist-één-hybride [2]
Voor gist enkel/dubbel hybride studies,
| Bmateriële spanning | MICROFOON (Ngram/ml) | |
| S. cerevisiae | ATCC9763 (diploïde) | 200-400 |
| SH3328 (haploïde) | 100 | |
| Sake gist (diploïde) | 100-200 | |
| Shochu-gist (diploïde) | 100 | |
| Biergist (triploïde of tetraploïde) | 100 | |
| Bakkersgist (diploïde) | 200-400 | |
| Schizofreen | JY-745 (monoploïde) | 100 |
| C.albicans | TIMM-0136 (diploïde) | 40 |
| C.tropicalis | TIMM-0324 (diploïde) | 80 |
Toepassingsgeval
Om de bindingsplaats van het GmWRKY31-eiwit op de promotor van het GmSAGT1-gen te bestuderen, werd in het gist-één-hybride-experiment de doel-DNA-sequentie ingevoegd in de pBait-AbAi-vector die het uracil-reportergen Ura3 bevat, stroomopwaarts van het AUR1-C-gen. Na gisttransformatie met het overeenkomstige plasmide werd het gesuspendeerd in 0,9% NaCl-oplossing en werd de OD600 aangepast tot 0,005. Vervolgens werd 100 μL van het monster uitgespreid op platen met 500 ng/mL AbA, omgekeerd en gekweekt bij 30℃ gedurende 3-5 dagen[3].
Figuur 3 Interactie van het GmWRKY31-eiwit met giststammen die fragmenten F16, F20, F73, delF16, delF20 of delF73 bevatten.
Gepubliceerde artikelen met onze reagentia
[1] Shunan Zhang, Yuyi Zhang, Kangning Li, et al. Stikstof bemiddelt bloeitijd en stikstofgebruiksefficiëntie via bloemregulatoren in rijst, Current Biology, Volume 31, Nummer 4, 2021, https://doi.org/10.1016/j.cub.2020.10.095. (ALS:10.834)
[2] Jiaying Kuang, Yingchun Xu, Yidan Liu, et al. Een op NnSnRK1 gecentreerd regulerend netwerk van schaduw-geïnduceerde vroege beëindiging van de bloei in lotus, Environmental and Experimental Botany, Volume 221, 2024, 105725, https://doi.org/10.1016/j.envexpbot.2024.105725. (ALS:5.7)
Gerelateerde producten
| Productnaam | Kat# | Specificatie |
| Ciprofloxacinehydrochloride | 60201ES05/25/60 | 5/25/100g |
| Ampicilline, natriumzout | 60203ES10/60 | 10/100 gram |
| Doxycyclinehyclaat | 60204ES03/08/25 | 1/5/25 gram |
| Chlooramfenicol, USP-klasse | 60205ES08/25/60 | 5/25/100g |
| Kanamycine Sulfaat | 60206ES10/60 | 10/100 gram |
| Tetracycline HCl Tetracyclinehydrochloride (USP) | 60212ES25/60 | 25/100 gram |
| Vancomycine Hydrochloride | 60213ES60/80/90 | 100mg/1g/5g |
| Gentamycine Sulfaat Zout | 60214ES03/08/25 | 1/5/25 gram |
| Spectinomycine Hydrochloride | 60215ES08 | 5 gram |
| Fleomycine (20 mg/ml in oplossing) | 60217ES20/60 | 20/5×20mg |
| Blasticidine S (Blasticidine) | 60218ES10/60 | 10/10×10mg |
| Nystatine | 60219ES08 | 5 gram |
| G418 Sulfaat (Geneticine) | 60220ES03/08 | 1/5 gram |
| Puromycine (oplossing 10 mg/ml) | 60209ES10/50/60/76 | 1×1 /5 ×1 / 1 0 ×1 /50 ×1 ml |
| Puromycine Dihydrochloride | 60210ES25/60/72/76/80 | 25/100/250/500mg/1g |
| Hygromycine B (50 mg/ml) | 60224ES03 | 1 g (20 ml)/10×1 g (20 ml) |
| Hygromycine B | 60225ES03/10 | 1/10 gram |
| Erythromycine | 60228ES08/25 | 5/25 gram |
| Tijd | 60230ES07/32 | 3,2/10×3.2 gram |
| Aureobasidine A (AbA) | 60231ES03/08/10 | 1/5×1/10×1mg |
| Polymyxine B-sulfaat | 60242ES03/10 | 1/10MU |
Referentiedocumentatie
[1] Paiano A, et al. Gist-twee-hybride-test om interacterende eiwitten te identificeren. Curr Protoc Protein Sci. 2019 feb;95(1):e70.
[2] John S, et al. Gist-één-hybride-assays: een historisch en technisch perspectief. Methoden. 2012 augustus;57(4): 441-447.
[3] Dong H, et al. Transcriptoomanalyse van sojaboon-WRKY TF's als reactie op Peronospora manshurica-infectie. Genomics. 2019 dec;111(6):1412-1422.