1 Eenactieprincipe

Hygromycine B is een aminoglycoside antibioticum dat wordt geproduceerd door het metabolisme van Streptomyces hygroscopicus. Het remt de eiwitsynthese door de translocatie te verstoren en het verkeerd lezen van 80S-ribosomen te bevorderen, waardoor prokaryotische en eukaryotische cellen worden gedood.

Tegenwoordig wordt het veel gebruikt voor het screenen en onderhouden van prokaryotische of eukaryotische cellen die het hygromycine-resistentiegen bevatten.

2 Toepassing

2.1 Screenen en onderhouden van de kweek van prokaryotische of eukaryotische cellen (plantencellen en zoogdiercellen) die stabiel zijn getransfecteerd met Hph+vectoren

De Hygromycine B resistentiegen (hyg of hph) afkomstig van Escherichia coli. codeert voor hygromycine B-fosfotransferase, dat hygromycine B omzet in een biologisch inactief gefosforyleerd product, waardoor ontgifting optreedt. Gezien dit principe is hygromycine B een zeer nuttige selecteerbare marker voor het screenen en onderhouden van gekweekte prokaryotische of eukaryotische cellen die succesvol zijn getransfecteerd met het hygromycineresistentiegen.

2.2 Vanwege het verschil in werkingswijze wordt hygromycine B vaak gebruikt in combinatie met geneticine G418, bleomycine en blasticidines om cellijnen te screenen die stabiel zijn getransfecteerd met twee verschillende vectoren.

Hygromycine B heeft een andere werkingswijze dan G418 (Cat#60220ES), Bleomycine (Cat#60257ES) en Blasticidines (Cat.nr. 60218ES), waardoor het zeer geschikt is voor gebruik in combinatie met andere selectieve antibiotica in dubbele selectie-experimenten.

2.3 Antiviraal middel
2.4 Als ontwormingsmiddel wordt het toegevoegd aan diervoeder en worden er dieren gefokt.
2.5 Screening van stabiel getransfecteerde cellen

De werkconcentratie van hygromycine B die wordt gebruikt om stabiele transfectanten te screenen, varieert afhankelijk van het celtype, medium, groeiomstandigheden en celmetabolisme. De aanbevolen concentratie is 50-1000 μg/mL. Voor het eerste gebruik van het experimentele systeem wordt aanbevolen om de optimale screeningconcentratie te bepalen door een kill-curve op te stellen, d.w.z. een dosis-responscurve. Over het algemeen 50-500 μg/mL voor zoogdiercellen; 20-200 μg/mL voor bacteriën/plantencellen; 200-1000 μg/mL voor schimmels.

3 Protocol

3.1 Bereiding van bewaaroplossing (50 mg/ml)

Weeg 0,5 g hygromycine B af en voeg 10 ml 1×PBS, pH 7,4, toe. Na volledige oplossing, filtreren met een 0,22 μm filter voor sterilisatie. Aliquoteer de gesteriliseerde oplossing en bewaar bij -20℃.

3.2 Veelgebruikte screeningconcentratie

De werkconcentratie van hygromycine B voor het screenen van stabiele stammen varieert afhankelijk van het celtype, kweekmedium, groeiomstandigheden en de celstofwisselingssnelheid. Het wordt aanbevolen om een ​​killcurve (dosis-responscurve) op te stellen om de optimale screeningconcentratie voor de eerste keer te bepalen. Over het algemeen, zoogdiercellen: 50-500 μg/ml; bacteriële/plantencellen: 20-200 μg/ml; schimmels: 300-1000 μg/ml.

3.3 Vaststelling van de dodencurve

【Opmerking】Om stabiele cellijnen te screenen, is het noodzakelijk om de minimale concentratie antibiotica te bepalen die in staat is om ongetransfecteerde gastheercellen te doden. Dit kan worden bereikt door een dodingscurve (dosis-responscurve) op te stellen. Er moeten ten minste vijf concentraties worden gerangschikt.

1) Dag 1: Niet-getransformeerde cellen worden in een geschikte kweekplaat geplaatst bij een celdichtheid van 20-25% en een nacht gekweekt.【Opmerking】Het aantal inoculatiecellen kan worden verhoogd voor cellen die een hogere dichtheid nodig hebben om vitaliteit te detecteren.

2) Stel de concentratiegradiënt in binnen het geschikte bereik volgens het celtype. Zoogdiercellen kunnen 50, 100, 250, 500, 750, 1000 μg/mL instellen. Verdun de Hygromycin B-oplossing 1:10 met gedemineraliseerd water of PBS-buffer tot 5 mg/mL. En verdun de oplossing vervolgens tot de overeenkomstige werkconcentratie volgens de volgende tabel.

Eindconcentratie (μg/ml)	Gemiddeld volume (ml)	Toevoegingsvolume van 5 mg/ml Hygromycine B (ml)
50	9.9	0.1
100	9.8	0,2
250	9.5	0,5
500	9.0	1.0
750	8.5	1.5
1000	8.0	2.0

3) Dag 2: Vervang door een vers bereid medium met de overeenkomstige concentratie van het medicijn. Maak drie parallelle monsters voor elke concentratie.

4) Vervang de media met medicijnen elke 3-4 dagen door nieuwe media.

5) Levende celtellingen worden uitgevoerd in een vaste cyclus (bijv. elke 2 dagen) om de juiste concentratie te bepalen om de groei van niet-getransfecteerde cellen te voorkomen. Kies de minimale concentratie die de meerderheid van de cellen binnen een ideaal aantal dagen doodt (meestal 7-10 dagen), als de werkconcentratie voor het screenen van stabiele cellijnen.

3.4 Screening van stabiele getransfecteerde cellen

1) 48 uur na transfectie werden de cellen gesubkweekt door screeningmedium met hygromycine B in de juiste concentratie (direct of verdund). 【Opmerking】Antibiotica werken het beste op actief delende cellen. Als de cellen te dicht zijn, zal het antibioticum de cellen niet doden. Splits de cellen zodanig dat de cellen niet meer dan 25% confluent zijn.

2) Vervang het zeefmedium elke 3-4 dagen.

3) Meet de celkolonievorming na 7 dagen screening. Kolonievorming kan nog een week of langer duren, afhankelijk van het type gastheercel, transfectie en effectiviteit van de screening.

4) Selecteer 5-10 resistente klonen en breng ze over naar 35 mm celkweekplaten. Ze worden gedurende 7 dagen gekweekt in een screeningmedium dat het geneesmiddel bevat.

5) Vervang het medium door vers medium zonder medicijnen voor de kweek.

4 Eigenschappen

Hygromycine B is een wit tot geelbruin poeder met een bijzondere geur, dat gemakkelijk oplosbaar is in water, methanol, ethanol, enz. en dat gemakkelijk zouten vormt met veel organische en anorganische zuren.

5 Productopslag

De oplossing kan direct bij 2~8℃ worden bewaard en kan langer dan 6 maanden worden bewaard.

6 Let op

1) De cellen die getransfecteerd zijn met het hph-gen zijn resistent tegen hygromycine en de getransfecteerde cellen brengen het gen stabiel of tijdelijk tot expressie.

2) Het hygromycine B-resistentiegen (hyg of hph) werd gevonden in andere stammen, waaronder Streptomyces hygroscopicus en Klebsiella pneumoniae, naast E. Coli.

7 Productaanbeveling

Yeasen biedt Hygromycine B in twee vormen, poeder (1 g/10 g, Cat#60225ES) en oplossing (50 mg/ml, Cat#60224ES).

Productnaam	Kat#	Specificatie
Hygromycine B (50 mg/ml)	60224ES03	1 gram (20 ml)
	60224ES10	10×1 gram (20 ml)
Hygromycine B	60225ES03	1 gram
	60225ES10	10 gram

8 Gepubliceerde artikelen met onze reagentia

[1] Zhao Q, Zheng K, Ma C, et al. PTPS vergemakkelijkt gecompartimenteerde LTBP1 S-nitrosylering en bevordert tumorgroei onder hypoxie. Mol cel . 2020;77(1):95-107.e5. doi:10.1016/j .molcel.2019.09.018 (IF:14.548)

[2] Wu LY, Shang GD, Wang FX, et al. Dynamische chromatinestatusprofilering onthult de regulerende rol van auxine en cytokineïne bij de regeneratie van scheuten. Dev-cel . 2022;57(4):526-542.e7. doi:10.1016/ j.devcel.2021.12.019 (IF:12.270)
[3] Zhang TQ, Chen Y, Wang JW. Een analyse van één enkele cel van de vegetatieve scheuttop van Arabidopsis. Dev-cel . 2021;56(7):1056-1074. e8. doi:10.1016/j.devcel.2021.02.021 (IF:12.270)
[4] Wang FX, Shang GD, Wu LY, Xu ZG, Zhao XY, Wang JW. Dynamiek van de toegankelijkheid van chromatine en een hiërarchische transcriptionele regulerende netwerkstructuur voor de somatische embryogenese van planten. Dev-cel . 2020;54(6):742-757.e8. doi:10.1016/j.devcel.2020.07.003 (IF:10.092)

[5] Zhu GD, Yu J, Sun ZY, et al. Genome-wide CRISPR/Cas9 screening identificeert CARHSP1 verantwoordelijk voor stralingsresistentie bij glioblastoom. Celdood Dis . 2021;12(8):724. Gepubliceerd 21 juli 2021. doi :10.1038/s41419-021-04000-3 (ALS:8.469)
[6] Chen J, Huang Y, Tang Z, et al. Genome-Scale CRISPR-Cas9 transcriptionele activatiescreening in metformine-resistentiegerelateerd gen van prostaatkanker. Frontcelontwikkeling Biol . 2021;8:616332. Gepubliceerd 26 jan. 2021. doi:10.3389/fcell.2020.616332 (ALS:6.684)
[7] Jiang Z, Cui Z, Zhu Z, et al. Engineering van Yarrowia lipolytica-transporters voor de zeer efficiënte productie van biobased barnsteenzuur uit glucose. Biotechnologie Biobrandstoffen . 2021;14(1):145. Gepubliceerd op 27 juni 2021. doi:10.1186/s13068-021-01996-w (IF:6.040)
[8] Liu Y, Jiang X, Cui Z, Wang Z, Qi Q, Hou J. Ontwikkeling van de oliehoudende gist Yarrowia lipolytica voor de productie van α-farneseen. Biotechnologie Biobrandstoffen . 2019;12:296. Gepubliceerd 23 dec 2019. doi:10.1186/s13068-019-1636-z (IF:5.452)
[9] Zhou C, Zeng Z, Suo J, et al. Manipulatie van een enkele transcriptiefactor, Ant1, bevordert de anthocyaanaccumulatie in gerstkorrels. J Landbouw Voedsel Chemie . 2021;69(18):5306-5317. doi:10.1021/acs.jafc.0c08147 (IF:5.279)

[10] Cui Z, Zheng H, Jiang Z, et al.Identificatie en karakterisering van de mitochondriale replicatieoorsprong voor stabiele en episomale expressie in Yarrowia lipolytica. ACS Synth Biol . 2021;10(4):826-835. doi:10.1021 /acssynbio.0c00619 (IF:5.110)

9 Gerelateerde producten

Productnaam	Kat#	Specificatie
Ciprofloxacinehydrochloride	60201ES05/25/60	5/25/100g
Ampicilline, natriumzout	60203ES10/60	10/100 gram
Doxycyclinehyclaat	60204ES03/08/25	1/5/25 gram
Chlooramfenicol, USP-klasse	60205ES08/25/60	5/25/100g
Kanamycine Sulfaat	60206ES10/60	10/100 gram
Tetracycline HCl Tetracyclinehydrochloride (USP)	60212ES25/60	25/100 gram
Vancomycine Hydrochloride	60213ES60/80/90	100mg/1g/5g
Gentamycine Sulfaat Zout	60214ES03/08/25	1/5/25 gram
Spectinomycine Hydrochloride	60215ES08	5 gram
Fleomycine (20 mg/ml in oplossing)	60217ES20/60	20/5×20mg
Blasticidine S (Blasticidine)	60218ES10/60	10/10×10mg
Nystatine	60219ES08	5 gram
G418 Sulfaat (Geneticine)	60220ES03/08	1/5 gram
Puromycine (oplossing 10 mg/ml)	60209ES10/50/60/76	1×1 /5 ×1 / 1 0 ×1 /50 ×1 ml
Puromycine Dihydrochloride	60210ES25/60/72/76/80	25/100/250/500mg/1g
Hygromycine B (50 mg/ml)	60224ES03	1 g (20 ml)/10×1 g (20 ml)
Hygromycine B	60225ES03/10	1/10 gram
Erythromycine	60228ES08/25	5/25 gram
Tijd	60230ES07/32	3,2/10×3.2 gram
Aureobasidine A (AbA)	60231ES03/08/10	1/5×1/10×1mg
Polymyxine B-sulfaat	60242ES03/10	1/10MU