1. Wat zijn dendritische cellen (DC)?
Dendritische cellen (DC's) zijn de meest effectieve antigeenpresenterende cellen (APC's) in het menselijk lichaam. DC's zijn de enige APC's die in staat zijn om naïeve T-celproliferatie robuust te stimuleren. Andere typen APC's (zoals monocyten, macrofagen, B-cellen, enz.) kunnen alleen geactiveerde of geheugen-T-cellen stimuleren. Daarom zijn DC-cellen de initiators van adaptieve T-cel-immuunreacties en spelen ze een uiterst belangrijke rol in tumorimmuniteit. DC-cellen brengen MHC-I- en MHC-II-moleculen sterk tot expressie op hun oppervlak en hebben specifieke oppervlaktemarkers. Ze nemen T-cellen op, verwerken ze en stimuleren ze om antigenen te activeren en bepalen uiteindelijk de differentiatierichting van T-cellen.
2. Bron van DC
DC-cellen zijn in zeer kleine hoeveelheden aanwezig in het lichaam. Het duurt lang om DC rechtstreeks uit het lichaam te isoleren en de celopbrengst is zeer laag, wat het onderzoek en de toepassing van DC sterk beperkt. DC kan echter worden gedifferentieerd en geïnduceerd uit DC-precursorcellen in verschillende weefsels, zoals precursorcellen in beenmergvloeistof, monocyten in perifeer bloed en navelstrengbloed.
Voor mensen is het meest gebruikte methode om DC te induceren uit humane perifere mononucleaire bloedcellen (PBMC) omdat menselijk perifeer bloed het gemakkelijkst te verkrijgen is en het grootste aantal monocyten bevat. Voor muizen is de meest gebruikte methode om DC te induceren uit beenmergcellen, namelijk uit beenmerg afkomstige dendritische cellen (BMDC).
Figuur 1. Schematisch diagram van de klassieke BMDC-bereidingsmethode
3. BMDC-bereidingsmethode
Veelgebruikte methoden voor het bereiden van muizen-BMDC's zijn:
3.1 Klassieke BMDC-kweekmethode - Inaba-methode (aangepast)
3.2 Grootschalige bereiding van BMDC - Sons-methode
3.3 Grootschalige bereiding van BMDC - Lutz-methode
3.1 [Klassieke BMDC-kweekmethode] - Inaba-methode (verbeterd)
【Achtergrond】
A. Het aantal BMDC's verkregen door de Inaba-methode is 5-7 x 106/muis;
B. De originele Inaba-methode gebruikt alleen GM-CSF om de productie van BMDC's te induceren. Hoewel de verkregen BMDC's een sterk stimulerend vermogen hebben in de gemengde lymfocytenreactie, is de rijpheid van DC's niet zo goed als die van de gecombineerde inductie van GM-CSF+IL-4. Daarom gebruikt de daaropvolgende verbeterde methode vaak de gecombineerde inductie van GM-CSF+IL-4.
【Teeltstappen】
3.1.1 Het verkrijgen van muizenbeenmergcellen
1) Muizen (6-10 weken oud) werden gedood door middel van cervicale dislocatie, alle dijbenen en scheenbenen werden operatief verwijderd en het spierweefsel rond de botten werd zoveel mogelijk verwijderd met scharen en pincetten.
[Opmerking] Beschadig de botten niet.
2) Verplaats het bot naar de schone werkbank en laat het 2 tot 5 minuten weken in een steriele kweekschaal met 70% alcohol om het te desinfecteren en steriliseren. Was het bot vervolgens twee keer met steriele PBS.
3) Verplaats het bot naar een andere nieuwe kweekschaal met PBS, knip de twee uiteinden van het bot met een schaar en gebruik vervolgens een injectiespuit om PBS te extraheren. Steek de naald in de beenmergholte vanaf beide uiteinden van het bot en spoel het beenmerg herhaaldelijk in de kweekschaal totdat het bot helemaal wit wordt.
4) Verzamel de beenmergsuspensie en filter kleine fragmenten en spierweefsel eruit met een nylon gaas van 200 mesh.
5) Centrifugeer het filtraat op 1200 toerental voor 5 minuten en gooi de bovenstaande vloeistof weg.
6) Voeg 2 ml ammoniumchloride rode bloedcellysisbuffer (1x) toe, resuspendeer de cellen en laat ze 3-4 dagen bij kamertemperatuur incuberen.5 minuten, tot 10 minuten
7) Voeg 10 ml PBS toe om het effect van de lysisbuffer te neutraliseren en centrifugeer vervolgens bij 1200 tpm gedurende 5 minuten en gooi de bovenstaande vloeistof weg.
8) Was eenmaal met PBS en resuspendeer de cellen vervolgens in RPMI1640 kweekmedium met 10% FBS. Er zijn muizenbeenmergcellen verkregen.
Bereiding van ammoniumchloride-lysisoplossing voor rode bloedcellen:
A. Bereid 10x bewaaroplossing als volgt: weeg 82,9 g NH4Cl, 10,0 g KHCO3 en 0,37 g Na2EDTA, oplossen in 1L gedestilleerd water, filteren met 0,22 μm-filtermembraan om te steriliseren en gedurende 6 maanden bij 4℃ te bewaren;
B. Verdun voor gebruik 10x bewaaroplossing met steriel gedestilleerd water in een verhouding van 1:9 tot 1x werkoplossing.
[Opmerking] Omdat ammoniumchloride-lysisoplossing voor rode bloedcellen een bepaald schadelijk effect heeft op beenmergcellen, moet de hemolysetijd zoveel mogelijk worden verkort.
3.1.2 Inductie van BMDC-differentiatie
1) Tel de muizenbeenmergcellen die in stap 1 zijn verkregen en pas de celconcentratie aan tot 0,5-1× 106/ml met RPMI 1640 compleet kweekmedium met 10% FBS.
2) Plaat in een 24-wells kweekplaat, 1 ml cellen per well, voeg recombinant muis GM-CSF (20 ng/ml) en IL-4 (10 ng/ml), en kweek in een 37℃, 5% CO2 broedmachine. Dit is de 0e dag van de cultuur.
【Opmerking】
A. Over het algemeen ongeveer 4-5x107 Beenmergcellen kunnen uit één muis worden geoogst, zodat er minimaal 40-50 putjes van een 24-wellsplaat kunnen worden geplateerd.
B. De concentratiebereiken van GM-CSF en IL-4 zijn 20-50 ng/ml en 10-40 ng/ml, respectievelijk.
3) Schud de kweekplaat voorzichtig om de 2 dagen en vervang vervolgens 3/4 van het volume met vers kweekmedium en vul de cytokinen aan.
4) Blaas tussen de 5e en 8e dag voorzichtig op het kweekmedium om zwevende cellen en loszittende cellen te verzamelen.
5) Centrifugeer op 1200 toerental voor 5 minuten en gooi de bovenstaande vloeistof weg.
6) Resuspendeer de cellen in RPMI 1640 compleet kweekmedium met 10% FBS en tel ze, pas vervolgens de celconcentratie aan tot 1×106/ml, en voeg recombinant muis GM-CSF (20 ng/ml) en IL-4 (10 ng/ml).
7 ) Plaats de cellen in kweekschalen van 100 mm (tot 10 ml per schaal) of in kweekplaten met 6 putjes (2 ml/putje).
8) Ga door met kweken in een omgeving van 37℃, 5% CO2 in een broedmachine gedurende 1-2 dagen.
9) Verzamel de gesuspendeerde cellen, dit zijn de meer volwassen BMDC's.
【Opmerking】
A. Stappen 2.5-2.8 zijn herplatingstappen. Het doel hiervan is om de in stap 2.4 verkregen BMDC rijper te maken.
B. Binnen 3 uur na het opnieuw uitplaten zijn veel stekelige aanhechtende cellen te zien die migreren van de DC-clusters. Na 1 dag kweken zijn deze aanhechtende cellen losgeraakt van de bodem van de kweekplaat en zijn veel typische DC's te zien drijven in het kweekmedium.
3.1.3 Volledige rijping van BMDC
[Opmerking] De BMDC's die in stap 2 zijn verkregen, zijn geen volledig volwassen DC's. Als u volledig volwassen DC's wilt verkrijgen, moet u nog steeds worden geïnduceerd door LPS, CD40L of TNF-a.
1) Centrifugeer de BMDC verkregen in stap 2.4 of 2.9 bij 1200 toerental voor 5 minuten en gooi de bovenstaande vloeistof weg.
2) Resuspendeer het neerslag met RPMI-compleet kweekmedium dat recombinant muis-GM-CSF bevat (20 ng/ml) en IL-4 (10 ng/ml), en pas de celconcentratie aan tot 1×106/ml na telling.
3) Voeg toe aan 24-wells kweekplaten en voeg rijpingsinductoren toe zoals TNF-α (250 Eenheden/ml), LPS (1 μg/ml), of CD40L (1 (μg/ml).
4) Cultuur in een 37℃, 5% CO2 2 dagen in een couveuse.
5) Verzamel de zwevende cellen en de cellen die losjes aan de wand vastzitten. Dit zijn volwassen dendritische cellen.
3.2【BMDC massaproductiemethode】-Zoon methode
【Achtergrond】
A. Met deze methode kan 30-40×10 worden verkregen6 DC/muis binnen 7 dagen, wat 7-10 keer zo hoog is als de klassieke Inaba-methode. Nadat DC is gecentrifugeerd door 14,5% metrizamidegradiënt, kan de zuiverheid (d.w.z. CD11c+/I-Ab+ cellen) 85-95% bereiken.
B. Het endocytosevermogen van DC verkregen met deze methode is zwakker dan dat van de klassieke Inaba-methode, maar de hoeveelheid uitgescheiden IL-12p70 is vergelijkbaar.
C. DC verkregen met deze methode heeft een sterker stimulerend vermogen in gemengde lymfocytenreactie dan de klassieke Inaba-methode.
D. DC verkregen via deze methode kunnen een sterkere specifieke T-celrespons induceren.
en Samenvattend kan gesteld worden dat de Son-methode een meer volwassen BMDC kan opleveren dan de klassieke methode.
【Teeltstappen】
3.2.1 Het verkrijgen van muizenbeenmergcellen
Zie de overeenkomstige stappen in de Inaba-methode (aangepast).
3.2.2 Bereiding van grote hoeveelheden BMDC
1) Tel de muizenbeenmergcellen die in stap 1 zijn verkregen en pas de celconcentratie aan tot 2×105/ml met RPMI 1640 compleet kweekmedium met 10% FBS.
2) Verdeel over kweekplaten met 6 putjes, 5 ml cellen per putje, voeg recombinant muis GM-CSF (1000 Eenheden/ml) en IL-4 (1000 Eenheden/ml), en kweek in een 37℃, 5% CO2 broedmachine.
3) Op de 4e dag van de kweek wordt het kweeksysteem aangevuld met recombinant muis GM-CSF (1000 Eenheden/ml) en IL-4 (1000 Eenheden/ml).
4) Verzamel DC's op de 7e dag van de cultuur, resuspendeer met 2-4 ml RPMI 1640 compleet kweekmedium, voeg toe aan een gelijk volume van 14,5% (w/v) mepanema en centrifugeer bij kamertemperatuur gedurende 20 min bij 1200xg.
5) Verzamel de middelste laag en was deze drie keer met RPMI 1640 compleet kweekmedium voor later gebruik.
[Opmerking] De DC is op dit punt een onvolwassen BMDC. Als u deze verder wilt laten rijpen, ga dan naar stap 3.
3.2.3 Volledige volwassenheid van BMDC
1) De BMDC's die in stap 2.4 zijn verzameld, opnieuw uitgeplaat en er is recombinant muis-GM-CSF (1000 Eenheden/ml) en IL-4 (1000 Eenheden/ml), evenals LPS (1-10 μg/ml) naar het cultuursysteem
2) Gekweekt in een 37℃, 5% CO2 incubator gedurende 2 dagen om volwassen BMDC's te verkrijgen.
3.3【BMDC-massapreparatiemethode】-Lutz-methode
【Achtergrond】
A. De Lutz-methode lijkt op de Son-methode. Met beide methoden kun je BMDC in grote hoeveelheden bereiden. De Lutz-methode wordt echter breder gebruikt dan de Son-methode.
B. Met deze methode kan meer BMDC worden verkregen, tot 1-3 x 108 DC/muis, en de zuiverheid kan 90-95% bereiken;
C. De cytokineconcentratie die bij deze methode wordt gebruikt, is veel lager dan die van de Son-methode, slechts 200 Eenheden/ml, en het daalt naar 30-100 Eenheden/ml van de 8e tot de 10e dag van de cultuur, wat de reagenskosten aanzienlijk kan besparen;
D. Het grootste verschil tussen deze methode en de klassieke Inaba-methode en de Son-methode is dat de beenmergcellen worden gekweekt in een bacteriële kweekschaal (Petrischaal) in plaats van een celkweekplaat. Inaba legde uit dat de bacteriële kweekschaal het voor macrofagen in het beenmerg niet gemakkelijk maakt om zich aan de wand te hechten, waardoor de ontwikkeling van macrofagen wordt geremd en het remmende effect van macrofagen op DC-rijping wordt vermeden. Dit is mogelijk de belangrijkste reden waarom deze methode een groot aantal BMDC's kan verkrijgen bij een lagere plaatdichtheid.
en De kweektijd van deze methode is echter relatief lang, met 10-12 dagen. Enerzijds is dit om meer BMDC's te verkrijgen. Anderzijds zijn de meeste granulocyten en lymfocyten moeilijk om zo lang te overleven, dus de zuiverheid van de uiteindelijk verkregen BMDC's kan worden verbeterd;
F. Deze methode gebruikt alleen GM-CSF voor inductiecultuur, en de verkregen BMDC's bevatten zowel onrijpe als rijpe DC's. Om de rijpheid verder te verbeteren, moet LPS of TNF-α nog 1-2 dagen inductie worden gebruikt, en de inhoud van rijpe DC-cellen zal 50-70% bereiken.
【Teeltstappen】
3.3.1 Het verkrijgen van muizenbeenmergcellen
Zie de overeenkomstige stappen in de Inaba-methode (aangepast) en merk op dat de hemolysestap moet worden weggelaten.
3.3.2 Grootschalige voorbereiding van BMDC
1) Tel de muizenbeenmergcellen die in stap 1 zijn verkregen en pas de celconcentratie aan tot 2×105/ml met RPMI 1640 compleet kweekmedium met 10% FBS;
2) Verdeel over 100 mm bacteriële kweekschalen (Petrischaal), 10 ml cellen per schaal, en voeg recombinant muis GM-CSF (200 Eenheden/ml), en kweek bij 37℃, 5% CO2 incubator;
[Opmerking] Er worden hier bacteriekweekschalen gebruikt, geen celkweekplaten.
3) Voeg op de 3e dag 10 ml compleet kweekmedium toe met 20 ng/ml recombinant muis GM-CSF aan de kweekschaal;
4) Op de 6e en 8e dag vervangt u de helft van het medium, dat wil zeggen, verzamel het oude kweekmedium, resuspendeer het celpellet met volledig kweekmedium dat 20 bevat ng/ml recombinant muis GM-CSF na centrifugatie, en doe de celsuspensie vervolgens terug in de oorspronkelijke schaal;
5) Op de 10e dag kunnen de cellen worden verzameld, dit zijn BMDC's.
3.3.3 Volledige rijping van BMDC's
1) Verzamel de gesuspendeerde cellen door de DC's op de 10e dag van de cultuur voorzichtig met een pipet te blazen en centrifugeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur op 300xg;
2) Gooi de supernatant weg, resuspendeer het celpellet met 10 ml RPMI 1640 compleet kweekmedium en verspreid het vervolgens op een celkweekplaat van 100 mm;
3) Voeg recombinante muis GM-CSF toe (100 Eenheden/ml) en TNF-α (500 Eenheden/ml), of recombinant muis GM-CSF (100 Eenheden/ml) en LPS (1 (μg/ml);
4) Ga door met kweken in een omgeving van 37℃, 5% CO2 in een broedmachine gedurende 1-2 dagen.
4. Identificatie van BMDC's
ik Morfologische observatie: De meeste BMDC's groeien in kolonies en de cellen hebben meerdere dendritische uitsteeksels, die duidelijker zichtbaar zijn bij volwassen BMDC's.
ik Celfenotypeanalyse: Flowcytometrie werd gebruikt om de expressie van CD11c, CD40, CD80, CD86, MHC klasse II moleculen (IA/IE) op het oppervlak van DC-cellen te detecteren. BMDC's brengen deze moleculen sterk tot expressie en de expressie van deze moleculen in volledig volwassen BMDC's zal verder toenemen.
ik Gemengde lymfocytenreactie (MLR): BMDC's hebben een sterk stimulerend vermogen, en hoe volwassener de cellen, hoe sterker het stimulerend vermogen.
5. Hoe kies je een rijpingsinductor?
LPS, CD40L en TNF-α zijn veelgebruikte en effectieve maturatie-inductoren voor zowel menselijke DC's als muizen-DC's. TNF-a heeft het zwakste vermogen om DC-maturatie te induceren van de drie. LPS en CD40L zijn beide sterke inductoren voor volledige DC-maturatie in vitro. De maturatie van DC's die door beide worden geïnduceerd, is vergelijkbaar, maar het geïnduceerde cytokinespectrum is anders. CD40L-geïnduceerde volwassen BMDC's vertonen het sterkste immuunregulerende vermogen in vivo, inclusief het genereren van beschermende en therapeutische tumorimmuunreacties. De concentratie die wordt gebruikt om volledige DC-maturatie met LPS te stimuleren, is over het algemeen 1-10 μg/ml, maar in feite heeft 0,1 μg/ml een heel sterk effect, maar voor verzekeringsdoeleinden, 1 μg/mL wordt over het algemeen gebruikt. Opgemerkt moet worden dat CD40L-moleculen tot de TNF-ligandfamilie behoren, die wordt gekenmerkt door het feit dat ze alleen kunnen functioneren na het vormen van trimeren. Daarom is het het beste om recombinant CD40L-trimeereiwit te gebruiken om DC te stimuleren, wat een goed effect zal hebben. Als CD40L-monomeren worden gebruikt om DC te stimuleren, is de volwassenheid in de meeste gevallen niet erg hoog.
6. Keuze van trainingsmethode
Tabel 1.Vergelijking van drie veelvoorkomende experimentele methoden voor het bereiden van BMDC
| Parameter | Klassieke BMDC-kweekmethode - Inaba-methode | Grootschalige bereiding van BMDC - Son-methode | Grootschalige bereiding van BMDC - Lutz-methode |
| Aantal citaten in PubMed | 783 | 24 | 663 |
| Beenmerghemolyse, lysis van rode bloedcellen | JA | JA | Nee |
| Het beenmerg verwijdert eerst de lymfocyten | JA | Nee | Nee |
| Verwijdering van granulocyten tijdens de kweek | JA | Nee | Nee |
| Initieel plaatvolume van beenmergcellen | 1 ml | 15 ml | 10 ml |
| Broedmachine | 24-well celkweekplaten | 6-well celkweekplaat | 100mm bacteriecultuurschaal |
| Kweekmedium | RPMI 1640+10% FCS | ||
| Concentratie van muis GM-CSF | 200-1000 Eenheden/ml | De initiële toegevoegde concentratie is 125-1000 Eenheden/ml Op de 4e en 7e dag worden voldoende hoeveelheden GM-CSF en IL-4 aan het kweeksysteem toegevoegd. | De initiële toegevoegde concentratie is 200 Eenheden/ml.3-100 Eenheden/ml na de 10e dag |
| Muis IL-4 | Hoeft niet | Behoefte，Concentratie is hetzelfde als GM-CSF | Hoeft niet |
| Vloeistofuitwisselingsmethode | Gooi op de 2e en 4e dag 50%-75% van het oude kweekmedium (dat cellen bevat) weg en vervang dit door vers, compleet kweekmedium met voldoende GM-CSF. | / | Op de 3e dag werd een gelijk volume compleet kweekmedium met GM-CSF toegevoegd. Op de 6e, 8e en 10e dag werd de helft van het medium vervangen. Het oude kweekmedium (met cellen) werd afgezogen, gecentrifugeerd, opnieuw gesuspendeerd in vers compleet kweekmedium met GM-CSF en vervolgens teruggeplaatst. |
| Cultuurtijd vóór de passage (expansie) | 6 dagen | 7 dagen | 10 dagen |
| Cultuurtijd na passage (rijping) | 2 dagen | Geen | 1-2 dagen |
| Inductor van volledige rijpheid | TNF-α(250 Eenheden/ml） | LPS(1-10 (μg/ml) | TNF-α(250 Eenheden/ml）of LPS(1) (μg/ml) |
| Tijdstip van DC-celoogst | 7-8 dagen | 7-8 dagen | 10-13 dagen |
| DC-zuiverheid | Dag 8：60-70% | Dag 7：85-95% | Dag 10-12：80-90% |
| DC-productie/muis | (5-7)×106 | (3-4)×107 | (1-3)×108 |
7. Aanbevolen DC-cultuurreagentia
| Productnaam | Kat | Maat |
| 91108EN | 5 μg/50 μg/100 μg/500 μg | |
| 90144ES | 5 μg/50 μg/100 μg/500 μg | |
| 90621ES | 5 μg/20 μg/50 μg/500 μg | |
| 94016ES | 25 μg/100 μg/500 μg |