1. Voorwoord
Macrofagen zijn grote fagocyten die zich onderscheiden van monocyten in het bloed. Ze zijn aanwezig in bijna alle weefsels, met name die welke frequent in contact staan met de buitenwereld, zoals de huid, longen en darmen. Macrofagen spelen een essentiële rol in veel biologische processen, zoals de menselijke immuunverdediging, ontstekingsreactie, weefselherstel, immuunregulatie en ziekteontwikkeling.
Primaire humane macrofagen zijn moeilijk in voldoende aantallen uit weefsels te isoleren en prolifereren niet in cultuur. Van monocyten afkomstige macrofagen vormen een uitstekend alternatief omdat monocyten in menselijk bloed gemakkelijk in grote hoeveelheden worden verkregen en in vitro kunnen worden gedifferentieerd tot macrofagen.
2. Biologische functies van macrofagen
- Fagocytose
Macrofagen herkennen en omhullen pathogenen en dode celresten via receptoren op hun oppervlak. Dit proces helpt niet alleen om infecties op te ruimen, maar voorkomt ook dat deze stoffen zich ophopen in het lichaam, wat ontstekingen of andere problemen kan veroorzaken.
- Anti-pathogeen verdediging
Macrofagen bestrijden ziekteverwekkers door chemicaliën te produceren die micro-organismen doden, zoals reactieve zuurstof- en stikstofoxiden, maar ook cytokinen en chemokinen die ontstekingsreacties reguleren.
- Ontstekingsregulatie
Macrofagen spelen een complexe rol in ontstekingsreacties. Ze kunnen niet alleen ontstekingen bevorderen door pro-inflammatoire cytokinen vrij te geven, zoals tumornecrosefactor alfa (TNF-α) en interleukine 1 (IL-1), maar ook ontstekingen remmen door anti-inflammatoire cytokinen te produceren, zoals IL-10 en TGF-β.
- Weefselherstel en -reconstructie
Na een ontstekingsreactie helpen macrofagen weefsels te herstellen en regenereren door verschillende groeifactoren af te scheiden. Ze ruimen de restanten van schade op en bevorderen de vorming van nieuw weefsel.
- Immunomodulatie
Macrofagen bevorderen specifieke immuunreacties door antigenen aan T-cellen te presenteren. Tegelijkertijd reguleren ze andere componenten van het immuunsysteem door verschillende cytokinen af te scheiden, zoals het reguleren van de activiteit van T-cellen en B-cellen.
- Relatie met ziekten
Macrofagen spelen een belangrijke rol bij de ontwikkeling van veel ziekten, waaronder infectieziekten, auto-immuunziekten, tumoren en chronische ontstekingsziekten zoals atherosclerose.
3. Classificatie van macrofagen
Macrofagen kunnen, afhankelijk van hun activeringsstatus en functie, worden onderverdeeld in twee hoofdcategorieën: M1 en M2. Deze twee subtypes spelen verschillende rollen in immuunreactie en ontstekingsregulatie.
M1-macrofagen
M1-macrofagen worden voornamelijk gestimuleerd door cytokines zoals interferon-gamma (IFN-γ) en tumornecrosefactor-alfa (TNF-α) en hebben pro-inflammatoire eigenschappen. Ze hebben een sterke antimicrobiële activiteit, kunnen zuurstofvrije radicalen en ontstekingsfactoren produceren en nemen deel aan het doden en opruimen van pathogene micro-organismen zoals bacteriën en virussen.
M1-macrofagen spelen een rol bij de immuunafweer en ontstekingsreactie van het lichaam, bevorderen de infiltratie van ontstekings- en immuuncellen, helpen bij het opruimen van geïnfecteerde en beschadigde weefsels en bevorderen het ontstaan en in stand houden van immuunontstekingsreacties.
M2-macrofagen
M2-macrofagen worden voornamelijk gestimuleerd door cytokines zoals interleukine-4 (IL-4) en interleukine-13 (IL-13), en hebben ontstekingsremmende en herstellende eigenschappen. Ze nemen deel aan weefselherstel- en regeneratieprocessen, bevorderen ontstekingsremmende reacties en immuunregulatie.
M2-macrofagen spelen een belangrijke rol in de late fase van ontsteking en weefselherstel. Ze bevorderen het oplossen van ontstekingen en weefselherstel, reguleren de balans van immuunreacties en bevorderen weefselregeneratie en -herstel.
Figuur 1. Samenvatting van de belangrijkste macrofaagpolarisatietoestanden van geactiveerde macrofagen [1]
4. Isolatie, kweek en differentiatie van macrofagen in vitro
4.1 Scheidingsmethode
- Isolatie uit perifeer bloed
Isolatie van monocyten: Perifere mononucleaire bloedcellen (PBMC's) worden geïsoleerd met behulp van dichtheidsgradiëntcentrifugatie (bijv. Ficoll-Paque). Het bloedmonster wordt toegevoegd aan de bovenste laag van Ficoll en na centrifugatie bevinden de monocyten zich tussen de plasma- en Ficoll-lagen.
Isolatie van macrofagen: Nadat de monocyten zijn geïsoleerd van PBMC's, kunnen de mononucleaire precursorcellen verder worden geïsoleerd door middel van plastic adhesie. Monocyten worden gedurende meerdere uren gekweekt in plastic kweekschalen, niet-adherente cellen worden verwijderd en de resterende adhesiecellen zijn voornamelijk mononucleaire precursorcellen.
- Isolatie van weefsels
Weefselmonsters worden afgebroken tot suspensies van afzonderlijke cellen door mechanische en/of enzymatische behandeling (bijv. collageenase en DNase). Niet-doelcellen worden verwijderd door dichtheidsgradiëntcentrifugatie of negatieve selectie (met behulp van antilichamen en magnetische kralen) en macrofagen worden verzameld.
4.2 Kweekmethode
Veelgebruikte kweekmedia zijn RPMI 1640 of IMDM, die meestal aangevuld moeten worden met 10% foetaal runderserum (FBS), 1% penicilline/streptomycine en de nodige groeifactoren. De kweekomstandigheden zijn meestal in een broedstoof bij 37°C en 5% CO2.
4.3 Differentiatie-inductiemethode
- Differentiatie van mononucleaire voorlopercellen
Gebruik van M-CSF: Voeg macrofaagkoloniestimulerende factor (M-CSF) toe aan het kweekmedium, doorgaans in een concentratie van 20-50 ng/ml, en blijf 7-10 dagen kweken om de differentiatie van mononucleaire voorlopercellen in macrofagen te induceren.
GM-CSF gebruiken: Granulocyt-macrofaag koloniestimulerende factor (GM-CSF) kan ook de differentiatie van macrofagen induceren, met name de neiging om M1 (pro-inflammatoire) macrofagen te produceren.
- Verdere regulering van fenotype en functie
M1-macrofagen: kan worden geïnduceerd door toevoeging van IFN-γ (interferon-γ) en LPS (lipopolysaccharide) aan het kweekmedium.
M2-macrofagen: kan worden geïnduceerd door het toevoegen van ontstekingsremmende cytokinen zoals IL-4 en IL-13.
Deze methoden stellen onderzoekers in staat om de verschillende biologische functies van macrofagen en hun gedrag onder pathologische omstandigheden in vitro te bestuderen. De specifieke bedrijfsomstandigheden van elke stap (zoals celdichtheid, kweektijd, concentratie van toegevoegde factoren, etc.) moeten mogelijk worden geoptimaliseerd op basis van het specifieke doel van het experiment.
Tabel 1.Macrofaagcultuur en inductieomstandigheden
| Celbron | Kweekmedium | Eerste toevoegingen | M1 polarisatie | M2 polarisatie |
| THP-1Cel | RPMI-1640 | 100 ng/ml PMA | 20 ng/ml IFN-γ 100 ng/ml LPS | 20 ng/ml IL-4 20 ng/ml IL-13 |
| Monocyten | RPMI-1640 | M1:50 ng/ml GM-CSF M2: 50 ng/ml M-CSF | 10 ng/ml LPS 50 ng/ml IFN-γ | M2a: 20 ng/ml IL-4 M2b: IgG+LPS M2c: 20 ng/ml TGF-β1 of 10 ng/ml IL-10 |
| Mpijl | Ik ben een IMDM | 10-50 ng/ml M-CSF | 100 ng/ml LPS (50ng/mL IFN-γ kan worden toegevoegd) | 10 ng/ml IL-4 (10 ng/ml IL-13 kan worden toegevoegd) |
| RAW264.7 cel | DMEM | / | 100 ng/ml LPS | 20 ng/ml IL-4 (20 ng/ml IL-10 kan worden toegevoegd） |
5. Analysegegevens
HiActive® Zeer Actieve Cytokinen：De biologische activiteit van elke cytokine is geverifieerd om de hoge activiteit van de cytokine te garanderen.
Gegevens voor activiteitsverificatie:
Recombinant M-CSF-eiwit van muizen
Figuur 1. Gemeten in een celproliferatietest met behulp van de M‑NFS‑60 muis myeloïde leukemie lymfoblastcellen. De ED50 voor dit effect is typisch 16,74 -25,83 ng/ml.
Recombinant Muis GM-CSF Eiwit
Figuur 2.De ED50 zoals bepaald door een celproliferatietest met behulp van muizen FDC-P1-cellen bedraagt 2,79-12,84 pg/ml.
Recombinant Menselijke IL-10 Eiwit
Figuur 3De ED50 zoals bepaald door een celproliferatietest met behulp van muizen MC/9-cellen is minder dan 0,1 ng/ml, wat overeenkomt met een specifieke activiteit van > 1,0×107 IE/mg.
Gerelateerde producten
| Classificatie | Soort | Kat | Specificatie |
| G-CSF | Menselijk | 2 μg/10 μg/50 μg/100 μg | |
| Muis | 2 μg/ 10 μg/ 50 μg/ 100 μg/ 500 μg | ||
|
M-CSF | Menselijk | 10 μg/100 μg/500 μg | |
| Muis | 10 μg/100 μg/500 μg | ||
|
GM-CSF | Menselijk | 5 μg/50 μg/100 μg/500 μg | |
| Muis | 10 μg/100 μg/ 500 μg | ||
| IFN-γ | Menselijk | 20 μg/50 μg/100 μg/500 μg | |
| Muis | 5 μg/50 μg/100 μg/500 μg | ||
| IL-4 | Menselijk | 5 μg/50 μg/100 μg/500 μg | |
| Muis | 5 μg/ 100 μg/ 500 μg | ||
| IL-10 | Menselijk | 2 μg/ 10 μg/ 50 μg/ 100 μg/ 500 μg | |
| Muis | 2 μg/ 10 μg/ 50 μg/ 100 μg/ 500 μg | ||
| IL-13 | Menselijk | 2 μg/ 10 μg/ 50 μg/ 100 μg/ 500 μg | |
| Muis | 2 μg/ 10 μg/ 50 μg/ 100 μg/ 500 μg |
Referenties
[1]Atri C, Guerfali FZ, Laouini D.Rol van menselijke macrofaagpolarisatie bij ontstekingen tijdens infectieziekten. Int J Mol Sci. 2018 19 juni;19(6):1801.