1.Achtergrond van Laminin 521
Laminine 521 (LN521) is een belangrijk celadhesie-eiwit in de natuurlijke stamcelniche en een matrix voor de kweek en expansie van humane embryonale (hES) en geïnduceerde pluripotente stamcellen (hiPSC). LN521 bindt zich aan celoppervlakreceptoren en activeert celsignaleringspaden, wat resulteert in de productie van functionelere cellen.
Laminine 521 reproduceert de biologisch relevante hPSC-omgeving in vitro, bevordert de hechting, hoge overleving en sterke langetermijnzelfvernieuwing van hPSC en is een belangrijk matrixeiwit dat de groei van stamcellen ondersteunt en de stabiliteit van de structuur en prestatie van het basaalmembraan handhaaft. Laminine 521 is ook een van de meest gebruikte voedingsvrije kweekmatrices. Bovendien kan Laminine 521 efficiënte single-cell passage van genetisch stabiele en pluripotente stamcellen bereiken zonder toevoeging van apoptose-remmers. De cellen groeien in een uniforme monolaag zonder dat er handmatig differentiatiegebieden hoeven te worden verwijderd. Bovendien hebben studies aangetoond dat LN521 de groei van PSC gedurende meer dan 10 generaties kan ondersteunen zonder tekenen van karyotype-afwijkingen en het vermogen van PSC om te differentiëren in de drie kiembladen van de binnenste, middelste en buitenste kiembladen behoudt.
Figuur 1. Structuur van laminine 521 [1]
2. Experiment met lamininecoating
2.1 Bereid laminine 521 voor op 400 µg/ml met steriel gedemineraliseerd water of water voor injectie. Het wordt aanbevolen om verder te verdunnen tot 100 µg/ml met steriele 1×DPBS (Ca++/Mg++) voor gebruik, en vervolgens te verdunnen tot een werkconcentratie van 5-10 µg/ml met steriele DPBS (Ca++/Mg++). De coatingconcentratie varieert afhankelijk van het type gekweekte cellen, en het wordt aanbevolen om het experimentele protocol te optimaliseren om de optimale coatingconcentratie voor de cellen te bepalen. Raadpleeg Tabel 1 voor aanbevolen concentraties.
Opmerking: DPBS met Ca2+ en Mg2+ moet worden gebruikt, aangezien divalente kationen belangrijk zijn voor de structuur en functie van eiwitten. De vereiste werkconcentratie van Laminin 521 is afhankelijk van de cellen en de toepassing. Wij raden een initiële coatingconcentratie van 0,5 μg/cm aan2.
Tabel 1. Aanbevolen volumes van recombinante humane laminine-werkoplossing voor verschillende kweekvaten.
| Petrischaal | Coatingconcentratie (μg/ml) | Toevoegingsbedrag van LN521 | Toevoegingsbedrag van 1*DPBS | Totaal volume |
| 6 goed | 5 | 50 μL/putje | 950 μL/putje | 1 ml/putje |
| 12 goed | 5 | 25 μL/putje | 475 μL/putje | 0,5 ml/putje |
| 24 goed | 5 | 15 μL/putje | 285 μL/putje | 0,3 ml/putje |
| 48 goed | 5 | 7,5 μL/putje | 142,5 μL/putje | 150 μL/putje |
| 96 goed | 5 | 3,5 μL/putje | 66.5 μL/putje | 70 μL/putje |
| 35mm Petrischaal | 5 | 50 μL/putje | 950 μL/putje | 1 ml/putje |
| 60mm Petrischaal | 5 | 100 μL/putje | 1900 μL/putje | 2 ml/putje |
| 100mm Petrischaal | 5 | 300 μL/putje | 5700 μL/putje | 6 ml/putje |
Het bovenstaande volume is gebaseerd op een coatingconcentratie van 5 μg/ml.
2.2 Voeg het opgegeven volume laminine-DPBS-mengsel toe aan elke well en schud voorzichtig. Zorg ervoor dat het hele oppervlak bedekt is met lamininecoatingoplossing, aangezien ongecoate oppervlakken geen celgroei ondersteunen.
2.3. Plaats de plaat in een 37°C incubator en incubeer een nacht. De minimale incubatietijd is 2 uur, maar incuberen een nacht wordt aanbevolen om ideale celkweekomstandigheden te verkrijgen. Zorg ervoor dat de kweekcontainer niet uitdroogt, want dat inactiveert LN521.
2.4. Wanneer de cellen klaar zijn om gezaaid te worden, aspireer dan de laminine 521-oplossing.
3.iPSC-cultuur
3.1 Ontdooien van iPSC (met een 12-wells plaat als voorbeeld)
3.1.1 Haal de iPSC's uit de vloeibare stikstof of het droogijs en laat ze 10 seconden ontdooien in water van 37°C.
3.1.2 Steriliseer de cryobuisjes met 75% alcohol en plaats ze op een werkblad.
3.1.3 Breng de cellen over naar een nieuwe centrifugebuis van 15 ml met 9 ml DMEM‑F12.
3.1.4 Centrifugeer de 15 ml centrifugebuis gedurende 5 minuten bij 300 g bij kamertemperatuur.
3.1.5 Gooi de laminine-oplossing uit de gecoate 12-wellsplaat weg.
3.1.6 Gooi de celsupernatant weg en resuspendeer de iPSC's voorzichtig in 1 ml mTeSR-plus (met 10 µM Y-27632) en breng ze over naar de gecoate 12-wells plaat. Schud de plaat om de cellen gelijkmatig te verdelen tot een uiteindelijke celdichtheid van 1×10^5 cellen/well en laat 10 minuten bij kamertemperatuur staan. Zorg ervoor dat de cultuur binnen 4-5 dagen wordt gepasseerd.
3.1.7 Plaats de 12-wellsplaat terug in de 37°C-incubator voor incubatie.
3.1.8 Het kweekmedium met ROCK-remmer moet na 12-16 uur worden verwijderd en de kweek moet worden voortgezet in het medium zonder remmer.
Tabel 2. Celzaaidichtheid in verschillende kweekvaten, celaantal bepaald volgens celgroeisnelheid
| Celcultuurvaten | 6 goed | 12 goed | 24 goed | 96 goed |
| Celnummer | 2,5~3,5×105 | 6~8×104 | 3~4×104 | 0,5~1×104 |
3.2. iPSC-passageprotocol
3.2.1 Gooi de kweeksupernatant weg en spoel met 1 ml PBS (Ca‑‑/Mg‑‑).
Opmerking: Gebruik PBS zonder Ca2+ en Mg2+, omdat divalente kationen een negatief effect hebben op sommige dissociatie-enzymen.
3.2.2 Gooi de PBS weg en voeg 0,5 ml Gentle Cell Dissociation Reagent toe.Laat het 6-8 minuten bij kamertemperatuur incuberen of bekijk het onder een microscoop totdat de cellen niet meer aan de plaat gebonden zijn.
3.2.3 Voeg een gelijk volume DMEM-F12 toe, meng de cellen voorzichtig, breng over naar een centrifugebuis bij kamertemperatuur en centrifugeer gedurende 5 minuten bij 300 g.
3.2.4 Bereid een met laminine gecoate 12-wells plaat voor voordat u de cellen doorgeeft.
3.2.5 Gooi de supernatant weg en resuspendeer de cellen in mTeSR-plus medium met 10 µM J‑27632.
3.2.6 Breng de cellen over naar de voorbereide laminine-gecoate 12-wells plaat. Schud de plaat voorzichtig om de cellen gelijkmatig te verdelen en laat 10 tot 20 minuten op kamertemperatuur staan.
3.2.7 Plaats de 12-wellsplaat in een broedstoof van 37°C en laat uitbroeden.
Opmerking: iPSC's zullen snel differentiëren en sterven nadat ze zijn uitgegroeid tot een monolaag. Om groei en pluripotentie te behouden, moeten ze worden gepasseerd voordat ze samenvloeien.
3.3. Cryopreservatie van iPSC
3.3.1 Bereid het zachte celdissociatiereagens voor.
3.3.2 Voer celscheiding uit volgens het iPSC-passageprotocol en gebruik het aantal celorganellen om de celdichtheid te garanderen vóór cryopreservatie.
3.3.3 Elke buis met cellen moet worden ingevroren bij een celdichtheid van 1-2×10^6. Volg de stappen van centrifugatie en verwijdering van celkweekmedium in het iPSC-passageprotocol. Resuspendeer het geïsoleerde iPSC-pellet in een geschikt volume cryopreservatieoplossing
3.3.4 Voeg 1 ml geresuspendeerde celcryopreservatiepellet toe aan een cryopreservatiebuis van 1,5 ml, voer het programmamatige koelproces uit en breng het vervolgens over naar vloeibare stikstof voor langdurige opslag.
4. Belangrijke opmerkingen over lamininecoating
4.1. Alle stappen in het experimentele protocol moeten onder steriele omstandigheden worden uitgevoerd.
4.2. Vermijd langdurige blootstelling van laminine aan kamertemperatuur.
4.3. Vermijd herhaaldelijk invriezen en ontdooien
4.4. Na ontdooien kan de onverdunde proteïnevoorraadoplossing bij 2~8℃ onder steriele omstandigheden worden bewaard en gedurende ten minste 3 maanden stabiel worden bewaard.
5.Gerelateerde productinformatie
| Productnaam | Kat# | Maat |
| 92602ES | 10μg/100μg/500μg/1mg |
6.Referenties
[1]Pulido D, Briggs DC, Hua J, Hohenester E. Kristallografische analyse van de laminine β2 korte arm onthult hoe het LF-domein wordt ingevoegd in een reguliere array van LE-domeinen. Matrix Biol. 2017 Jan;57-58:204-212.