Puromycin is een aminoglycoside antibioticum geproduceerd door Streptomyces alboniger. Het is een analoog van het 3'-uiteinde van het aminoacyl-tRNA-molecuul en kan binden aan de A-site van het ribosoom, waardoor het wordt opgenomen in de uitstrekkende peptideketen, waardoor de peptidetranslocatie op het ribosoom wordt verstoord, wat leidt tot voortijdige ketenbeëindiging tijdens de translatie en zo de eiwitsynthese remt.
Figuur 1 Structuurformule van Puromycine (CAS NO. 53-79-2)
Het pac-gen, dat codeert voor puromycine N-acetyltransferase (pac), werd aangetroffen in de puromycine-producerende bacterie Streptomyces alboniger, wat resistentie tegen puromycine verleent. Deze eigenschap wordt nu op grote schaal gebruikt om stabiele getransfecteerde cellijnen van zoogdieren te screenen die plasmiden met het pac-gen dragen. Het wijdverbreide gebruik van puromycine bij het screenen van stabiele cellijnen is gerelateerd aan de eigenschappen van lentivirale vectoren, waarvan de meeste het pac-gen dragen in commerciële lentivirale vectoren. In bepaalde specifieke gevallen kan puromycine ook worden gebruikt om E. coli-stammen te screenen die zijn getransformeerd met plasmiden die het pac-gen dragen. Puromycine werkt snel en kan bij lage concentraties snel celdood veroorzaken. Aanhangende zoogdiercellen zijn gevoelig voor concentraties van 2-5 µg/ml van puromycine, terwijl suspensiecellen al gevoelig zijn voor concentraties zo laag als 0,5-2 µg/mL puromycine. Zoogdiercellen met stabiele resistentie tegen puromycine kunnen binnen een week worden gegenereerd.
Screening van stabiele cellijnen
Experimenteel principe
Door het klonen van exogeen DNA/shRNA in een vector die het pac-gen draagt, wordt de recombinante vector getransfecteerd in gastcellen en geïntegreerd in hun chromosomen, stabiel overgedragen met celdeling en ten slotte gescreend met puromycine.
Voorbereiding en pre-experiment
1 Aanbevolen gebruiksconcentraties
Zoogdiercellen: 1-10 μg/ml, de optimale concentratie moet voorafgaand aan het experiment worden bepaald.
E. coli: Gebruik voor het screenen van stabiele getransformeerde E. coli die het pac-gen dragen op LB-agarmedium een concentratie van 125 μg/ml. Nauwkeurige pH-aanpassing is vereist voor puromycinescreening van stabiele E. coli-transformanten.
2 Oplossingsmethode
Los puromycine op in gedestilleerd water om een voorraadoplossing van 50 mg/ml te bereiden, steriliseer met een filter van 0,22 μm, verdeel in aliquots en bewaar bij -20°C.
3 Bepaling van de Puromycin Kill Curve (met behulp van shRNA-transfectie of lentivirale transductie als voorbeeld)
De effectieve screeningconcentratie van puromycine is gerelateerd aan celtype, groeistatus, celdichtheid, celmetabolisme en de celcycluspositie. Het is cruciaal om de minimale concentratie puromycine te bepalen die ongetransfecteerde cellen doodt. Het is essentieel om een Puromycin-gradiëntscreening-pre-experiment uit te voeren voor het eerste experiment om een killcurve vast te stellen.
- Plaatcellen met een dichtheid van 5~8×104cellen/putje in een 24-wells plaat en kweek gedurende de nacht.
- Bereid screeningsmedium voor: vers medium met verschillende concentraties puromycine (bijv. 0-15 μg/ml, minimaal 5 gradiënten).
- Vervang het door vers bereid screeningmedium, blijf kweken en observeer de celgroei. Vervang het verse screeningmedium elke 2-3 dagen.
- Controleer dagelijks de overleving van de cellen; de concentratie van het medicijn die binnen 4-6 dagen alle niet-getransfecteerde cellen effectief doodt, is de minimale concentratie.
Screening van stabiele transfectanten
- Na lentivirale infectie gedurende 48-72 uur (70-80% confluentie), kweek cellen in medium met een geschikte concentratie Puromycin gedurende ten minste 48 uur. Wanneer alle cellen in de niet-getransfecteerde controlegroep met puromycine sterven, zijn de resterende cellen in de met virus geïnfecteerde groep allemaal positieve cellen.
【Opmerking】: ① Het effect van antibiotica is het meest uitgesproken wanneer cellen zich in een actieve delingsfase bevinden. De werkzaamheid van antibiotica wordt aanzienlijk verminderd als de cellen te dicht zijn. De celdichtheid mag niet hoger zijn dan 25%. ② Observeer dagelijks de celgroeistatus; puromycinescreening vereist ten minste 48 uur en de effectieve concentratie van puromycinescreening duurt gewoonlijk 3 tot 10 dagen. Hoe hoger de MOI van het virus, hoe meer kopieën van shRNA en puromycineresistentiegen elke cel bevat. Bij het uitvoeren van puromycinescreening geldt: hoe hoger de MOI, hoe meer pac-kopieën de cellen bevatten en hoe hoger de concentratie puromycine die ze kunnen verdragen. Pas de concentratie puromycine aan om getransfecteerde cellen te screenen, maar de concentratie puromycine mag niet lager zijn dan de minimale effectieve concentratie van de kill-curve;
- Voeg kweekmedium met de minimale concentratie Puromycin toe om de cellen te laten groeien. Nadat de qPCR-testresultaten gekwalificeerd zijn, kunt u doorgaan met cryopreservatie.
| ProductS naam | Kat# | Specificatie | Verschijning |
| Puromycin Dihydrochloride CAS-nummer: 58-58-2 | 60210ES25 | 25mg | Wit tot een witachtig poeder |
| 60210ES60 | 100mg | ||
| 60210ES72 | 250mg | ||
| 60210ES76 | 500mg | ||
| 60210ES80 | 1 G | ||
| Puromycin (Oplossing 10 mg/ml) CAS-nummer: 58-58-2 | 60209ES10 | 1×1 ml | Oplossing (10 mg/ml in H2O) |
| 60209ES50 | 5×1 ml | ||
| 60209ES60 | 10×1 ml | ||
| 60209ES76 | 50×1 ml |
Productaanbeveling
Publicaties van klanten die dit product gebruiken (gedeeltelijke statistieken: enkele)
[1] Zhang D, Liu Y, Zhu Y, et al. Een niet-canonieke cGAS-STING-PERK-route faciliteert het translationele programma dat cruciaal is voor veroudering en orgaanfibrose. Nat-celbiol . 2022;24(5):766- 782. doi:10.1038/s41556-022-00894-z (IF:28.824)
[2] Lu T, Zhang Z, Zhang J, et al. CD73 in kleine extracellulaire blaasjes afkomstig van HNSCC definieert tumor-geassocieerde immunosuppressie gemedieerd door macrofagen in de micro-omgeving. J Extracell-vesikels . 2022;11(5):e12218. doi:10.1002/jev2.12218 (IF:25.841)
[3] Meng F, YuZ, Zhang D, et al.Geïnduceerde fasescheiding van mutant NF2 zet het cGAS-STING-mechanisme vast en heft zo de antitumorimmuniteit op. Mol cel . 2021;81(20):4147-4164.e7.doi: 10.1016/j.molcel.2021.07.040 (IF:17.970)
[ 4] Chen S, Liu S, Wang J, et al. TBK1-gemedieerde DRP1-targeting zorgt voor nucleïnezuurdetectie om mitochondriale dynamiek en fysiologie te herprogrammeren. Mol cel . 2020;80(5):810-827.e7.doi:10.1016 /j.molcel.2020.10.018 (IF:15.584)
[5] Zhao Q, Zheng K, Ma C, et al. PTPS vergemakkelijkt gecompartimenteerde LTBP1 S-nitrosylering en bevordert tumorgroei onder hypoxie. Mol cel . 2020;77(1):95-107.e5. doi:10.1016/j.molcel.2019.09.018 (IF:14.548)
[6] Mo J, Liu F, Sun X, et al. Remming van het FACT-complex richt zich op afwijkende egelsignalering en overwint resistentie tegen gladgestreken antagonisten. Kankeronderzoek . 2021;81(11):3105-3120. doi:10.1158/0008-5472.CAN-20-3186 (IF:12.701)
[7] Zou Y, Wang A, Shi M, et al al. Analyse van redoxlandschappen en dynamiek in levende cellen en in vivo met behulp van genetisch gecodeerde fluorescerende sensoren. Nat-protocol . 2018;13(10):2362-2386. doi:10.1038/s41596-018-0042-5 (IF:12.423)
[8] Mao L, Chen J, Lu X, et al. Proteomische analyse van longkankercellen onthult een cruciale rol van BCAT1 bij de metastasering van kankercellen. Theranostiek. 2021;11(19):9705-9720. Gepubliceerd op 27 september 2021. doi:10.7150/thno.61731 (ALS:11.556)
[9] Han L, Zhang F, Liu Y, et al al. Uterus globulin associated protein 1 (UGRP1) bindt podoplanine (PDPN) om een nieuw ontstekingspad te bevorderen tijdens een Streptococcus pneumoniae-infectie. Klinische vertaling Med. 2022;12(6):e850. doi:10.1002/ctm2.850 (IF:11.492 )
[10] Zhang M, Liu F, Zhou P, et al. Het MTOR-signaalpad reguleert de differentiatie van macrofagen uit myeloïde voorlopers van muizen door autofagie te remmen. Autofagie . 2019;15(7):1150-1162. doi:10.1080/15548627.2019. 1578040 (IF:11.059)
[11] Zhang S, Yang Z, Bao W, et al. SNX10 (sorterende nexine 10) remt de initiatie en progressie van colorectale kanker door de autofagische afbraak van SRC te controleren. Autofagie . 2020;16(4):735 -749. doi:10.1080/15548627.2019.1632122 (IF:11.059)
[12] Zhang Y, Ding H, Wang X, et al. MK2 bevordert de afbraak van Tfcp2l1 via β-TrCP-ubiquitineligase om de zelfvernieuwing van embryonale stamcellen van muizen te reguleren. Cel Rep . 2021;37(5):109949. doi:10.1016/j.celrep.2021.109949 (IF:9.423)
[13] Jiang Y, Dong Y, Luo Y, et al. AMPK-gemedieerde fosforylering op 53BP1 bevordert c-NHEJ. Cel Rep . 2021;34(7):108713. doi:10.1016/j.celrep.2021.108713 (IF:9.423)
[14] Zon Q, Ye Y, Gui A, et al. MORTALIN-Ca 2+ as stuurt aangeboren rituximab-resistentie aan bij diffuus grootcellig B-cellymfoom. Kanker Lett . 2022;537:215678. doi:10.1016/j.canlet.2022.215678 (ALS:8.679)
[15] Jin R, Zhao A, Han S, et al. De interactie van S100A16 en GRP78 actieve stoffen in het endoplasmatisch reticulum, gemedieerd door stress via het IRE1α/XBP1-pad bij renale tubulo-interstitiële fibrose. Celdood Dis . 2021;12(10):942. Gepubliceerd 13 okt. 2021. doi: 10.1038/s41419-021-04249-8 (ALS:8.469)
[16] Zhang P, Zhang Z, Fu Y, et al.K63-gekoppelde ubiquitinatie van DYRK1A verlicht de door TRAF2 Sprouty 2 gemedieerde afbraak van EGFR. Celdood Dis . 2021;12(6):608. Gepubliceerd 2021 11 juni. doi:10.1038/s41419-021-03887-2 (ALS:8.469)
[17] Zhao T, Li Y, Shen K, Wang Q, Zhang J. Knockdown van OLR1 verzwakt het glycolytische metabolisme om de proliferatie en chemoresistentie van dikkedarmkankercellen te onderdrukken door SULT2B1 te downreguleren via c-MYC. Celdood Dis. 2021;13(1):4. Gepubliceerd 17 dec. 2021. doi: 10.1038/s41419-021-04174-w (ALS:8.469)
[18] Zhou R, Wu Q, Wang M, et al. De proteïnefosfatase PPM1A defosforyleert en activeert YAP om de regeneratie van de darm en lever van zoogdieren te regelen. PLoS Biol . 2021; 19(2):e3001122. Gepubliceerd op 25 februari 2021. doi:10.1371/journal.pbio.3001122 (IF:8.029)
[19] Wu S, Wang S, Lin X, Yang S, Ba X, Xiong D, Xiao L, Li R. Lanatoside C remt de replicatie van herpes simplex-virus 1 door de distributie van NRF2 binnen cellen te reguleren. Fytomedicijnen. 2024 feb;124:155308. doi: 10.1016/j.phymed.2023.155308. (ALS:7.9)
[20] Shen K, Song W, Wang H, Wang L, Yang Y, Hu Q, Ren M, Gao Z, Wang Q, Zheng S, Zhu M, Yang Y, Zhang Y, Wei C, Gu J. Het decoderen van het metastatische potentieel en optimale postoperatieve adjuvante therapie van melanoom op basis van de metastasescore. Celdood ontdekking. 25 okt. 2023;9(1):397. doi: 10.1038/s41420-023-01678-6. (ALS:7.0)
Gerelateerde producten
| Productnaam | Kat# | Specificatie |
| Ciprofloxacinehydrochloride | 60201ES05/25/60 | 5/25/100g |
| Ampicilline, natriumzout | 60203ES10/60 | 10/100 gram |
| Doxycyclinehyclaat | 60204ES03/08/25 | 1/5/25 gram |
| Chlooramfenicol, USP-klasse | 60205ES08/25/60 | 5/25/100g |
| Kanamycine Sulfaat | 60206ES10/60 | 10/100 gram |
| Tetracycline HCl Tetracyclinehydrochloride (USP) | 60212ES25/60 | 25/100 gram |
| Vancomycine Hydrochloride | 60213ES60/80/90 | 100mg/1g/5g |
| Gentamycine Sulfaat Zout | 60214ES03/08/25 | 1/5/25 gram |
| Spectinomycine Hydrochloride | 60215ES08 | 5 gram |
| Fleomycine (20 mg/ml in oplossing) | 60217ES20/60 | 20/5×20mg |
| Blasticidine S (Blasticidine) | 60218ES10/60 | 10/10×10mg |
| Nystatine | 60219ES08 | 5 gram |
| G418 Sulfaat (Geneticine) | 60220ES03/08 | 1/5 gram |
| Puromycine (oplossing 10 mg/ml) | 60209ES10/50/60/76 | 1×1 /5 ×1 / 1 0 ×1 /50 ×1 ml |
| Puromycine Dihydrochloride | 60210ES25/60/72/76/80 | 25/100/250/500mg/1g |
| Hygromycine B (50 mg/ml) | 60224ES03 | 1 g (20 ml)/10×1 g (20 ml) |
| Hygromycine B | 60225ES03/10 | 1/10 gram |
| Erythromycine | 60228ES08/25 | 5/25 gram |
| Tijd | 60230ES07/32 | 3,2/10×3.2 gram |
| Aureobasidine A (AbA) | 60231ES03/08/10 | 1/5×1/10×1mg |
| Polymyxine B-sulfaat | 60242ES03/10 | 1/10MU |