- Achtergrond
De in dit rapport samengevatte gegevens zijn uitgevoerd door
De samenvattingsgegevens zijn alleen ter referentie voor de gebruiker en de gebruiker moet de mycoplasmamethode verifiëren door zijn eigen monsters te gebruiken om te bevestigen dat de methode aan de vereisten van de gebruiker kan voldoen. Alle laboratoria die deze kit gebruiken, wordt aanbevolen de volgende parameters te verifiëren: Detectielimiet, Specificiteit en Robuustheid.
Validatie-inhoud:
| Prestatie | Validatieparameters | Validatie Resultaten |
| Detectielimiet | Detectielimiet voor mycoplasma-stammen | Detectielimiet voor 10 typen farmacopee-mycoplasma: 10 CFU/ml, elk 24 keer getest met een detectiepercentage van ≥95%. |
| Specificiteit | Voorbeeld matrixinterferentie | Er zijn 9 verschillende monstermatrices en DNA-verdunningsoplossingen getest, maar er is geen mycoplasma gedetecteerd. |
| Kruisreactiviteit | Er zijn 14 stammen en 6 veelgebruikte cellen in de biofarmaceutica getest, maar er is geen mycoplasma aangetroffen. | |
| Duurzaamheid | Vries-dooi stabiliteit | Kan 20 herhaalde vries- en ontdooicycli doorstaan zonder dat de prestaties van de kit worden beïnvloed. |
| Stabiliteit van thermische versnelling | Onaangetast bij 37°C gedurende 14 dagen en 4°C gedurende 30 dagen. | |
| Compatibiliteit van instrumenten | Compatibel met ABI7500, ABI QuantStudio™5, Bio-Rad CFX96 en Roche LightCycler®480. | |
| Dekking | Dekking van Mycoplasma DNA-typen | Databasevergelijking met behulp van mycoplasma 16S rRNA-sequenties bestrijkt 183 soorten binnen de klasse Mollicutes. |
- Experimentele materialen en methoden
2.1 MijnCawayTM Mycoplasma Real-time qPCR Detection Kit (2G), Leverancier:
2.2 MolPuurTM Magnetische rest-DNA-monstervoorbereidingskit, leverancier:
2.3 De Mycoplasma-gevoeligheidsnormen worden gekocht bij Minerva Biolabs (MB), waarvan de stammen afkomstig zijn van de National Collection of Type Cultures (NCTC). De gevoeligheidsnormen zijn geïnactiveerde mycoplasma en worden gebruikt voor de methodologische verificatie van de nucleïnezuuramplificatiemethode (qPCR/PCR-methode) voor mycoplasmadetectie. In totaal worden 10 soorten mycoplasma's gekocht, waaronder de vereisten van EP 2.6.7 en JP G3. De informatie over de normen is als volgt:
| Leverancier | Cat.nr. | NCTC-nr. | ATCC Nee. | Materiaalnaam |
| Minerva Biolabs (MB) | 102-1003 | 10129 | 23838 | 10KVE™ Gevoeligheidsstandaard Mycoplasma arginine |
| 102-2003 | 10112 | 23714 | 10KVE™ Gevoeligheidsstandaard Mycoplasma orale | |
| 102-3003 | 10115 | 19610 | 10KVE™ Gevoeligheidsstandaard Mycoplasma gallisepticum | |
| 102-4003 | 10119 | 15531 | 10KVE™ Gevoeligheidsstandaard Mycoplasma pneumonie | |
| 102-5003 | 10124 | 25204 | 10KVE™ Gevoeligheidsstandaard Mycoplasma-synoviae | |
| 102-6003 | 10117 | 19989 | 10KVE™ Gevoeligheidsstandaard Mycoplasma fermentans | |
| 102-7003 | 10130 | 17981 | 10KVE™ Gevoeligheidsstandaard Mycoplasma hyorhinis | |
| 102-8003 | 10116 | 23206 | 10KVE™ Gevoeligheidsstandaard Acholeplasma laidlawii | |
| 102-9003 | 10164 | 27556 | 10CFU™ Gevoeligheidsstandaard Spiroplasma citroen | |
| 102-11003 | 10113 | 23064 | 10KVE™ Gevoeligheidsstandaard Mycoplasma speekselklieren |
2.4 Originele gegevens: de elektronische versie werd vastgelegd in het 'Experimenteel rapport' het subbestand van het bovenliggende bestand 'MycAwayTM Mycoplasma Real-time qPCR Detectiekit (2G)'.
2.5 Methoden: De materialen en werkwijzen die voor het experiment werden gebruikt, werden in principe door de fabrikant geproduceerd of vastgesteld.
- Kwalificatie-inhoud en resultaten
3.1 Detectielimiet (LOD)
Nucleïnezuurextractie en detectie van de 10 CFU/mL Mycoplasma standaardstam werden uitgevoerd volgens de instructies voor de standaardstam en de instructies voor de extractie- en detectiekit. In totaal werden 24 assays verkregen voor de 10 CFU/mL Mycoplasma standaardstam. NCS (Negative Control Sample) en NTC (No Template Control) monsters werden gelijktijdig getest in elk experiment.
Uit de resultaten bleek dat de NCS- en NTC-resultaten bevredigend waren en dat alle 24 monsters van 10 CFU/ml positief testten. Daarmee werd voldaan aan de eis van minimaal 23 positieve resultaten uit 24 tests.
| Nee. | Materiaalnaam | Concentratie van bacteriële vloeistof |
| 1 | Mycoplasma arginine | 10 KVE/ml |
| 2 | Mycoplasma orale | 10 KVE/ml |
| 3 | Mycoplasma gallisepticum | 10 KVE/ml |
| 4 | Mycoplasma pneumonie | 10 KVE/ml |
| 5 | Mycoplasma-synoviae | 10 KVE/ml |
| 6 | Mycoplasma fermentans | 10 KVE/ml |
| 7 | Mycoplasma hyorhinis | 10 KVE/ml |
| 8 | Acholeplasma laidlawii | 10 KVE/ml |
| 9 | Spiroplasma citroen | 10 KVE/ml |
| 10 | Mycoplasma speekselklieren | 10 KVE/ml |
Tabel 1 Informatie over gevalideerde stammen
| 10 KVE/ml | Experiment 1 | Experiment 2 | Experiment 3 |
| Detectiepercentage | 8/8 | 8/8 | 8/8 |
| Totaal | 24/24 | ||
Tabel 2 Resultaten van de detectielimiet
3.2 Specificiteit
3.2.1 Mycoplasma-testbereik
De primer probe-sequenties in de kit werden vergeleken met het 16S rRNA-genoom in de database. Door middel van bioinformatica-analyse werd verkregen dat de MycAwayTM De Mycoplasma qPCR Detection Kit (Probe Method) van NextSense Biologicals kan ten minste 183 soorten zoöxanthellen dekken, waaronder 120 Mycoplasma, 9 Ureaplasma, 33 Spiroplasma en 7 Cholestrongyla, enzovoort.
3.2.2 Voorbeeld matrixinterferentie
9 substraten (Dulbecco's MEM, Ham's F-10 Medium, M-199 Medium, Ham's F-12K Kaighn's, RPMI-1640 Medium, McCoy's 5A, Ham's F-12K Kaighn's+1.0mM/L Glutamine, L-15 LEIBOVITZ MEDTA +2.05 mM L-Glutamine, DMEM-laag glucose standaardmedium) worden gebruikt als monsters om de interferentie van de monstermatrix te verifiëren. De resultaten lieten zien dat het medium geen interferentie veroorzaakt met de reagentia uit de kit.
3.2.3 Detectiebereik van flexibacteria
Extractie en detectie van geïnactiveerd mycoplasma (Mycoplasma arginini, Mycoplasma orale, Mycoplasma gallisepticum, Mycoplasma pneumoniae, Mycoplasma synoviae, Mycoplasma fermentans, Mycoplasma hyorhinis, Acholeplasma laidlawii, Spiroplasma citri, Mycoplasma salivarium) bij 10 CFU/mL is vereist, samen met NCS- en NTC-monstertesten.
Uit de resultaten bleek dat NCS en NTC niet werden gedetecteerd en de resultaten waren negatief. Alle 10 mycoplasma-soorten werden gedetecteerd en de resultaten waren positief.
3.2.4 Kruisreactie
Voor 14 niet-flexibacteriële stammen, waaronder Clostridium (Clostridium perfringens, Clostridium acetobutylicum), Lactobacillus (Lactobacillus acidophilus), Streptococcus (Streptococcus mutans, Streptococcus pneumoniae), een aantal andere veel voorkomende bacillus-coccus-fungi micro-organismen (Staphylococcus epidermidis, Acinetobacter baumannii, Enterobacter aerogenes, Micrococcus garciniae, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonalbacterium leucocephala, Salmonella enterica enteritidis subsp. enterica, Bacillus subtilis, Bacillus subtilis en Bacillus sp. Bacillus cereus, Bacillus cereus), en zes gemanipuleerde cellen (HEK293, 293T, Vero, CHO, E. coli, SF9) werden gebruikt voor mycoplasmadetectie met behulp van de MolPuurTM Magnetische kralenmethode voor preprocessingkit voor rest-DNA-monsters (flessen) en de MycAwayTM Mycoplasma qPCR Detection Kit (Probe Method) (2G), en elk experiment werd gelijktijdig uitgevoerd met de PCS-, NCS- en NTC-monstertest.
Uit de resultaten bleek dat de PCS-, NCS- en NTC-resultaten bevredigend waren; de testmonsters waren negatief en er trad geen kruisreactiviteit op.
3.3 Robuustheid
3.3.1 Vries-dooi stabiliteit
De Mycoplasma-testkit werd onderworpen aan vries-dooi-experimenten onder omstandigheden van -25℃~-15℃. Uit de resultaten bleek dat de kit bestand was tegen 20 keer herhaaldelijk invriezen en ontdooien, zonder dat de prestaties werden beïnvloed.
3.3.2 Versnelde stabiliteit
De Mycoplasma-detectiekit werd gedurende 14 dagen verhit tot 37℃ en gedurende 30 dagen tot 4℃. Uit de resultaten bleek dat de productprestaties niet werden beïnvloed.
3.3.3 Toepasbaarheid van het instrument
Voor de mycoplasmadetectiekit werden verschillende concentraties positieve controle en Mycoplasma pneumoniae-DNA in de kit gebruikt als te testen monsters. De experimenten werden uitgevoerd op vier verschillende merken en modellen, namelijk respectievelijk Thermo Scientific ABI7500, Thermo Scientific ABI Q5, Shanghai Hongshi SLAN-96S en Roche LightCycler®480.De experimenten werden uitgevoerd op qPCR-instrumenten van vier verschillende merken en modellen: Shanghai Hongshi SLAN-96S en Roche LightCycler®480.
Uit de resultaten bleek dat de te testen monsters werden gedetecteerd op qPCR-instrumenten van verschillende fabrikanten en dat de negatieve controleresultaten gekwalificeerd waren. Bovendien werd de prestatie van de kit niet beïnvloed.
- 4.Referentie
4.1 Mycoplasma-onderzoeksmethode <3301>. Chinese Farmacopee, Deel III [S]. Beijing: China Science and Technology Press, 2020: 542-543.
4.2 Richtlijnen voor validatie van analytische methoden <9101>. Chinese Farmacopee, Deel III [S]. Beijing: China Science and Technology Press, 2020: 682.
4.3 Richtlijnen voor validatie van alternatieve methoden voor microbiologische testen van farmaceutische producten <9201>. Chinese Farmacopee, Deel III [S]. Beijing: China Science and Technology Press, 2020: 684.
4.4 Mycoplasma's. Europese Farmacopee[S]. 10e editie, 2020: Sectie 2.6.7, 194-199.
4.5 Mycoplasma-testen voor celsubstraten die worden gebruikt voor de productie van biotechnologische/biologische producten <G3-14-170>. De Japanse farmacopee[S]. 18e editie, 2021: 2678-2682.
4.6 Erica J. Fratz-Berilla, Phillip Angart, Ryan J. Graham, et al. Impact op productkwaliteitskenmerken van monoklonale antilichamen geproduceerd in CHO-celbioreactorculturen tijdens opzettelijke mycoplasma-contaminatiegebeurtenissen. Biotechnologie en bio-engineering. 2020;117(9): 2802-2815.
4.7 Dmitriy V. Volokhov, Laurie J Graham, Kurt A Brorson, Vladimir E Chizhikov. Mycoplasma-testen van celsubstraten en biologische middelen: overzicht van alternatieve niet-microbiologische technieken. Mol Cell Probes. 2011 apr-jun;25(2-3):69-77.
4.8 AL Ingebritson, CP Gibbs, C. Tong, GB Srinivas. Een PCR-detectiemethode voor het testen van Mycoplasma-contaminatie van veterinaire vaccins en biologische producten. Lett in Applied Microbiology. 2015 Feb;60(2):174-180.
Bestelgegevens
| Beschrijving | Onderdeelnummer |
| 18461ES | |
| MycAway™ Mycoplasma qPCR-detectiekit (2G) | 40619ES |