Ct-waarde is een cruciale uitkomstrepresentatie in fluorescente kwantitatieve PCR. Het wordt gebruikt om verschillen in genexpressieniveaus of genkopieaantallen te berekenen. Dus, welk bereik van Ct-waarden kan als redelijk worden beschouwd bij fluorescentiekwantificering? Hoe kunnen we ervoor zorgen dat de Ct-waarden binnen een effectief bereik vallen? Laten we Xiao Yi vandaag deze vraag voor iedereen laten beantwoorden.
Wat is de Ct-waarde?
In het qPCR-amplificatieproces verwijst de Ct-waarde naar het aantal amplificatiecycli (Cycle Threshold) waarbij het fluorescentiesignaal van het geamplificeerde product de ingestelde fluorescentiedrempel bereikt. "C" staat voor Cycle en "T" staat voor Threshold. Simpel gezegd is de Ct-waarde het aantal cycli dat het duurt voordat de starttemplate in qPCR een bepaalde hoeveelheid product bereikt, wat later verder wordt uitgelegd.
Wat is de functie van de Ct-waarde?
1. Relatie tussen exponentiële amplificatie, templatehoeveelheid en Ct-waarde
In een ideaal scenario worden genen tijdens qPCR exponentieel versterkt en accumuleren ze gedurende een bepaald aantal cycli. De relatie tussen het aantal amplificatiecycli en de hoeveelheid product kan worden uitgedrukt als: de hoeveelheid versterkt product = initiële templatehoeveelheid × (1 + En) ^ aantal cycli. QPCR-reacties vinden echter niet altijd plaats onder ideale omstandigheden. Wanneer de hoeveelheid versterkt product een "bepaalde producthoeveelheid" bereikt, is het aantal cycli op dit punt de Ct-waarde, wat de periode van exponentiële amplificatie aangeeft. De relatie tussen de Ct-waarde en de initiële templatehoeveelheid is als volgt: er is een lineaire relatie tussen de Ct-waarde van een template en de logaritme van het initiële kopienummer van die template. Een hogere concentratie van initiële template resulteert in een lagere Ct-waarde, terwijl een lagere concentratie van initiële template leidt tot een hogere Ct-waarde.
2. Versterkingscurve, fluorescentiedrempel en een bepaalde producthoeveelheid
De hoeveelheid qPCR-amplificatieproducten wordt direct weergegeven in de vorm van fluorescentiesignalen, wat bekend staat als de amplificatiecurve. In de vroege stadia van PCR, wanneer de amplificatie onder ideale omstandigheden plaatsvindt en het aantal cycli laag is, is de accumulatie van producten minimaal en is het geproduceerde fluorescentieniveau niet significant te onderscheiden van de achtergrondfluorescentieruis. Vervolgens gaat de productie van fluorescentie de exponentiële fase in. De hoeveelheid PCR-product kan worden gedetecteerd op een bepaald punt wanneer de reactie net de exponentiële fase ingaat, wat de "bepaalde producthoeveelheid" wordt genoemd. Dit kan worden gebruikt om de initiële inhoud van de template af te leiden. Daarom staat de fluorescentiesignaalintensiteit die overeenkomt met de bepaalde producthoeveelheid bekend als de fluorescentiedrempel.
In de latere stadia van PCR vertoont de amplificatiecurve geen exponentiële amplificatie meer en gaat deze over in de lineaire fase en de plateaufase.
3. De reproduceerbaarheid van Ct-waarden
Wanneer de PCR-cycli het aantal cycli bereiken waarbij de Ct-waarde optreedt, is het net de echte exponentiële amplificatiefase ingegaan. Op dit punt zijn kleine fouten niet versterkt, dus de reproduceerbaarheid van Ct-waarden is uitstekend. Dit betekent dat, ongeacht of dezelfde template op verschillende tijdstippen of in verschillende buizen op hetzelfde moment wordt versterkt, de verkregen Ct-waarden constant blijven.
Wat is het bereik van Ct-waarden?
1. Versterkingsefficiëntie En
De PCR-amplificatie-efficiëntie heeft betrekking op de efficiëntie waarmee de polymerase het doelgen omzet in amplificatieproducten.De amplificatie-efficiëntie is 100% wanneer één DNA-molecuul wordt omgezet in twee DNA-moleculen. Amplificatie-efficiëntie wordt doorgaans aangeduid als En. Voor het gemak van de analyse in volgende artikelen volgt hier een korte introductie van de factoren die de amplificatie-efficiëntie beïnvloeden.
| Beïnvloedende factoren | Uitleg | Oordelen |
| A. PCR-remmers | 1. Het template-RNA kan stoffen bevatten die de PCR-reactie remmen, zoals onder andere eiwitten of detergentia. 2. Het cDNA dat na reverse transcriptie wordt verkregen, kan hoge concentraties template-RNA en componenten van de reverse transcriptiereagentia bevatten, die ook de daaropvolgende PCR kunnen remmen. | 1. De aanwezigheid van contaminatie kan worden vastgesteld door de A260/A280- en A260/A230-verhoudingen te meten of door RNA-elektroforese uit te voeren. 2. Of het cDNA na reverse transcriptie in een bepaalde verhouding verdund is. |
| B. Onredelijk primerontwerp | Primer kan niet effectief gloeien. | Controleer of er dimeren of haarspeldstructuren in de primers zitten en of er mismatches zijn. Soms is het nodig om aandacht te besteden aan het ontwerp van de overspannende introns. |
| C. Ongeschikte reactieprocedure | 1. De primers kunnen niet effectief gloeien. 2. De activiteit van DNA-polymerase wordt niet volledig vrijgegeven. 3. Door aanhoudende hoge temperaturen neemt de activiteit van DNA-polymerase af. | 1. De gloeitemperatuur is hoger dan de Tm-waarde van de primer. 2. De pre-denaturatietijd is te kort. 3. De duur van elke fase in het reactieprotocol is te lang. |
| D.Reagentia niet goed gemengd of pipetteerfouten | In het reactiesysteem is de lokale concentratie van PCR-reactiecomponenten te hoog of ongelijkmatig, wat resulteert in niet-exponentiële amplificatie van de PCR. | / |
| E.Amplicon lengte | De ampliconlengte is te lang, meer dan 300 basenparen, wat resulteert in een lage amplificatie-efficiëntie. | Controleer of de ampliconlengte tussen de 80 en 300 basenparen ligt. |
| F. De impact van qPCR-reagentia | Een lagere concentratie DNA-polymerase in de reagentia of suboptimale ionenconcentraties in de buffer zorgen ervoor dat het Taq-enzym niet zijn maximale activiteit bereikt. | De standaardcurve wordt gebruikt om de amplificatie-efficiëntie van de primers te meten. |
2. Het bereik van Ct-waarden
Het bereik van Ct-waarden is 15-35. Een Ct-waarde van minder dan 15 wordt beschouwd als binnen de basislijnfase en heeft de fluorescentiedrempel nog niet bereikt. Idealiter is er een lineaire relatie tussen de Ct-waarde en de logaritme van het initiële kopienummer van de template, wat bekend staat als de standaardcurve. Met behulp van de standaardcurve wordt, wanneer de amplificatie-efficiëntie 100% is, de Ct-waarde voor het kwantificeren van een enkele kopie van het gen berekend op ongeveer 35. Als de Ct-waarde groter is dan 35, is het initiële kopienummer van de template theoretisch kleiner dan 1, wat statistisch gezien als niet-significant kan worden beschouwd.
Voor verschillende genen vereist het Ct-waardebereik, als gevolg van variaties in de oorspronkelijke templatehoeveelheid genkopieën en de amplificatie-efficiëntie, het creëren van een standaardcurve voor dat gen om het lineaire detectiebereik van het gen te berekenen.
3.Factoren die de Ct-waarden beïnvloeden
Zoals aangegeven door de relatie tussen het aantal amplificatiecycli en de hoeveelheid product: Amplificatieproducthoeveelheid = Initiële templatehoeveelheid × (1 + En)^aantal cycli, is te zien dat onder ideale omstandigheden de initiële templatehoeveelheid en En de Ct-waarde beïnvloeden. Verschillen in templatekwaliteit of amplificatie-efficiëntie kunnen ervoor zorgen dat de Ct-waarde te hoog of te laag is.
4. Ct-waarden zijn te hoog of te laag
Xiao Yi raadpleegde de experts van de technische afdeling van ons bedrijf en vatte de oorzaken en oplossingen voor de twee meest voorkomende soorten problemen met Ct-waarden samen om onze lezers te informeren.
| Probleem | Oorzaken | Oplossingen |
| Ct-waarde te hoog | De templateconcentratie is laag of er zijn PCR-remmers aanwezig. De versterkingsefficiëntie is laag. | 1. Verhoog de templateconcentratie; of verhoog de verdunningsverhouding van RNA of cDNA; of bereid de template opnieuw voor. 2. Verlaag de gloeitemperatuur of gebruik een tweestapsversterkingsmethode; zorg ervoor dat de componenten en het systeem grondig gemengd zijn; optimaliseer het reactieprotocol; of probeer de reagentia te vervangen. |
| Ct-waarde te laag | 1. Hoge sjabloonconcentratie 2. Verontreiniging in NTC (No Template Control) en NRC (No Reverse Control) 3. Onjuist primerontwerp | 1. Verminder de hoeveelheid template-RNA of verdun het cDNA in een hogere verhouding. 2. Vervang alle reagentia opnieuw of gebruik UDGase anti-besmettingsreagentia. 3. Optimaliseer de procedure om niet-specifieke amplificatie te vermijden. |
Hiermee is de analyse van de abnormale Ct-waardeoorzaken voor dit probleem afgerond. Vervolgens zal Xiao Yi een reeks kosteneffectieve producten aanbevelen om ervoor te zorgen dat uw experimentele gegevens nauwkeuriger en betrouwbaarder zijn. Kom en kies uw favorieten!
| Productnaam | Kat# | Maat |
| Hieff UNICON™ Universele Blauwe qPCR SYBR Groene Master Mix | 11184ES08 | 5×1 ml |
| Hifair™ Ⅲ 1e streng cDNA-synthese SuperMix voor qPCR (gDNA-digestor plus) | 11141ES60 | 100 ton |
| Hifair™ AdvanceFast One-step RT-gDNA Digestion SuperMix voor qPCR | 11151ES60 | 100 ton |
| Hifair™ AdvanceFast 1st Strand cDNA Synthesis Kit (zonder kleurstof) | 11150ES60 | 100 ton |