Fluorescente kwantitatieve PCR (qPCR) is een veelgebruikte techniek in laboratoria, die kan worden toegepast op genexpressieanalyse, genotypering, pathogeendetectie, SNP-analyse en meer. De werking van qPCR is eenvoudig en het principe ervan is gemakkelijk te begrijpen. Nu, geconfronteerd met een stapel rommelige data, wordt het analyseren van de resultaten een ontmoedigende taak. Vandaag zal Xiao Yi u begeleiden bij het vereenvoudigen van complexe processen en het eenvoudig verkrijgen van data die kunnen worden gepubliceerd in SCI-tijdschriften!
Veelgebruikte analysemethoden in qPCR omvatten relatieve kwantificering en absolute kwantificering, en de keuze tussen deze methoden moet gebaseerd zijn op verschillende experimentele ontwerpen. In dit nummer richten we ons op een veelgebruikte toepassing van qPCR: genexpressieanalyse, waarbij de relatieve kwantificeringsmethode over het algemeen wordt geselecteerd.
Experimenteel ontwerp
Stel dat we op dit moment het effect van lichtinductie op de expressie van het Arabidopsis AtSUC2-gen moeten bestuderen. De controlegroep zou bestaan uit Arabidopsis-planten die geen enkele behandeling hebben ondergaan, terwijl de experimentele groep planten zou zijn die zijn behandeld met een bepaalde lichtinductie. RNA zou uit beide groepen worden geëxtraheerd en omgekeerd worden getranscribeerd om cDNA te verkrijgen, dat vervolgens als template zou worden gebruikt. Het Arabidopsis GAPDH-gen zou worden geselecteerd als interne referentie voor het qPCR-experiment.
De qPCR-putten die moeten worden opgezet, zijn als volgt:
1) NTC (No Template Control) wordt gebruikt om te verifiëren of er sprake is van contaminatie in het PCR-systeem.
2) NRT (Geen omgekeerde transcriptie) verwijst naar het gebruik van RNA dat geen omgekeerde transcriptie heeft ondergaan als template, dat dient als controle op gDNA-verontreiniging.
3) De intern referentiegen wordt gebruikt om verschillen te corrigeren die worden veroorzaakt door verschillende beginconcentraties van monsters.
4) De selectie van controlemonsters valt over het algemeen in de volgende categorieën:
- Om het effect van een bepaalde behandeling op de genexpressie te beoordelen, wordt het onbehandelde monster gebruikt als referentiemonster.
- Om de verschillen in genexpressie op verschillende tijdstippen te detecteren, wordt het monster op tijdstip 0 gebruikt als referentiemonster.
- Om de verschillen in genexpressie tussen verschillende weefsels te vergelijken, wordt willekeurig één weefsel geselecteerd als referentiemonster.
Eén punt om hier op te merken is dat voor elk hierboven genoemd materiaal 3 PCR-putjes (1, 2, 3) zijn opgezet. Dit zijn PCR-duplicaten, ook wel technische replicaten genoemd, die bedoeld zijn om operationele fouten te elimineren en de amplificatie-efficiëntie nauwkeurig te evalueren. Daarnaast moeten biologische replicaten worden opgezet, waarbij hetzelfde experiment wordt uitgevoerd op verschillende materialen (verschillende tijden, planten, batches, reactieplaten) om de biologische variabiliteit te kalibreren en te analyseren of de behandeling statistisch significant is. Specifiek in dit geval hebben zowel de experimentele groep als de controlegroep minstens twee extra sets Arabidopsis-monsters (A, B, C) nodig om te worden verwerkt. RNA wordt uit elke set geëxtraheerd en omgekeerd getranscribeerd, gevolgd door qPCR. Voor statistische analyse wordt het gemiddelde van de drie biologische replicaten gebruikt.
Resultaatanalyse — ΔΔCt-methode
Het kenmerk van de ΔΔCt-methode is dat deze uitsluitend op de Ct-waarden vertrouwt voor de berekening, maar het uitgangspunt is dat de amplificatie-efficiëntie van het doelgen en het referentiegen relatief consistent moet zijn en beide binnen het bereik van 90-110% vallen.
De specifieke berekeningsformule is als volgt:
ΔCt = Ct (doelgen) - Ct (referentiegen)
ΔΔCt = ΔCt (experimentele groep) - ΔCt (controlegroep)
RQ = 2^(-ΔΔCt)
Uitgaande van het bovenstaande experiment, waarbij het effect van lichtinductie op de expressie van het AtSUC2-gen van Arabidopsis werd onderzocht, zijn de resultaten van qPCR als volgt:
Tijdens de berekening berekenen we eerst het gemiddelde van de 2^-△Ct-gegevens voor de controlegroep (zoals weergegeven in de afbeelding hierboven, wat 0,00116 is). Vervolgens delen we elke waarde van 2^-△Ct door dit gemiddelde om de waarde van 2^-△△Ct te verkrijgen. Ten slotte ordenen we deze waarden om het gemiddelde en de standaarddeviatie te verkrijgen, wat aangeeft dat het expressieniveau van het doelgen in de experimentele groep met ongeveer 9,73-voudig is verhoogd in vergelijking met de controlegroep.
De resultaten worden met behulp van Graphpad-software als volgt weergegeven:
De P-waarde die met de t-toets van de software is berekend, bedraagt 0,0024. Dit is kleiner dan 0,05. Dit wijst op een statistisch significant verschil en de resultaten zijn betrouwbaar.
Resultaatanalyse — Dual Standard Curve-methode
In praktische toepassingen is het, omdat de amplificatie-efficiëntie van het doelgen en het referentiegen vaak verschillend is, noodzakelijk om primers opnieuw te ontwerpen en reactieomstandigheden te optimaliseren om dezelfde amplificatie-efficiëntie te bereiken. We kunnen echter ook een handigere methode kiezen, de dual-standard curve-benadering.
Laten we hier eerst de analysemethode van absolute kwantificering begrijpen. De specifieke stappen zijn om het doelfragment te amplificeren via PCR, vervolgens het doelfragment in een kloonvector te plaatsen, het recombinante plasmide te extraheren en nadat sequentiebepaling heeft bevestigd dat het correct is, kan het worden gebruikt als standaard. De hoeveelheid plasmide-DNA kan worden gemeten met behulp van instrumenten zoals Nanodrop, en het kopie-aantal wordt omgezet in specifieke plasmidekopieën met behulp van de kopie-aantalconversieformule. Daarna wordt het DNA geamplificeerd na een reeks verdunningen. Er wordt een standaardcurve uitgezet met de logaritme van het standaardkopie-aantal als de x-as en de gemeten Ct-waarden als de y-as. Op basis van de Ct-waarde van het onbekende monster kan het absolute kopie-aantal worden berekend.
Formule voor het berekenen van het aantal kopieën:
Kopie-aantal = (massa ÷ relatieve moleculaire massa) × 6,02 × 10^23
De dual-standard curve-methode omvat het afzonderlijk construeren van standaardmonsters voor het doelgen en het referentiegen, het uitvoeren van absolute kwantificering en het creëren van standaardcurven. Na het berekenen van het absolute kopie-aantal van de onbekende monsters, wordt een vergelijking gemaakt, wat een hogere nauwkeurigheid biedt.
De specifieke berekeningsformule is als volgt:
Q = Aantal kopieën van het doelgen / Aantal kopieën van het referentiegen
RQ = Q (experimenteel) / Q (controle)
In het hierboven genoemde experiment, waarin het effect van lichtinductie op de expressie van het AtSUC2-gen van Arabidopsis wordt onderzocht, werden standaardmonsters voor zowel AtSUC2 als GAPDH geconstrueerd en werden de volgende standaardcurven voorbereid:
De Ct-waarden voor het doelgen en het interne referentiegen in de te testen monsters zijn als volgt:
Tijdens de berekening worden eerst de Ct-waarden van het doelgen en het interne referentiegen gesubstitueerd in de lineaire relatie van de standaardcurve om de absolute kopie-aantallen van het doelgen en het interne referentiegen te verkrijgen in zowel de experimentele als de controlegroep. Vervolgens wordt met behulp van de formule Q = aantal kopieën van het doelgen / aantal kopieën van het referentiegen het expressieniveau van het doelgen genormaliseerd.Ten slotte wordt de RQ volgens de formule RQ = Q (experimenteel) / Q (controle) berekend op 9,71. Dit geeft aan dat het expressieniveau van het doelgen in de experimentele groep 9,71 keer hoger is dan dat in de controlegroep.
De resultaten worden met behulp van de GraphPad-software als volgt weergegeven:
De P-waarde die met de t-toets van de software is berekend, bedraagt 0,0008. Dit is kleiner dan 0,05. Dit wijst op een statistisch significant verschil en de resultaten zijn betrouwbaar.
Daarmee is de qPCR-data-analyse voor deze sessie afgerond. Vervolgens zal ik een reeks kosteneffectieve producten aanbevelen om ervoor te zorgen dat uw experimentele data nauwkeuriger en betrouwbaarder zijn. Kom ze ophalen!
| Productnaam | Kat# | Maat |
| Hieff UNICON™ Universele Blauwe qPCR SYBR Groene Master Mix | 11184ES08 | 5×1 ml |
| Hifair™ Ⅲ 1e streng cDNA-synthese SuperMix voor qPCR (gDNA-digestor plus) | 11141ES60 | 100 ton |
| Hifair™ AdvanceFast One-step RT-gDNA Digestion SuperMix voor qPCR | 11151ES60 | 100 ton |
| Hifair™ AdvanceFast 1st Strand cDNA Synthesis Kit (zonder kleurstof) | 11150ES60 | 100 ton |