Werk langs beide lijnen, miRNA-expressieanalyse is eenvoudiger gemaakt
De lengte van volwassen miRNA is slechts ongeveer 20nt, meestal zal de forward primer de volledige lengte bedekken of zelfs een overtollig deel hebben, en de reverse primer zal nergens geplaatst kunnen worden. De huidige marktoplossing is om de lengte van het reverse transcript te vergroten tijdens reverse transcriptie. Veelvoorkomende methoden zijn de tailing-methode en de stem-loop-methode.
1. Inleiding
2. Aanbevolen producten
3. Gerelateerde productlijst
1. Inleiding
MicroRNA's (miRNA's) zijn enkelstrengs kleine RNA's met een grootte van ongeveer 21-23 basen, die worden gegenereerd uit enkelstrengs RNA-precursoren met een haarspeldstructuur van ongeveer 70-90 basen na Dicer-enzymverwerking. miRNA bindt voornamelijk specifiek aan het 3'-uiteinde niet-coderende gebied van het doelgen mRNA en reguleert het translatieproces van post-transcriptioneel doelgen mRNA, waardoor mRNA-translatie wordt geblokkeerd en mRNA-afbraak wordt bevorderd, wat resulteert in verminderde eiwitexpressie. De rol van miRNA's is betrokken bij het voorkomen en de ontwikkeling van verschillende cardiovasculaire ziekten zoals ontogenie, weefseldifferentiatie, celproliferatie en apoptose.
Figuur 1. Schematisch diagram van miRNA-synthese in vivo
De lengte van volwassen miRNA is slechts ongeveer 20nt, meestal zal de forward primer de volledige lengte bedekken of zelfs een overtollig deel hebben, en de reverse primer zal nergens geplaatst kunnen worden. De huidige marktoplossing is om de lengte van het reverse transcript te vergroten tijdens reverse transcriptie. Veelvoorkomende methoden zijn de tailing-methode en de stem-loop-methode.
Figuur 2. miRNA-synthese door middel van tailing-methode
Figuur 3. miRNA-synthese door de stam-lusmethode
De tailing-methode gebruikt PolyA-polymerase om Poly(A)-staart toe te voegen aan volwassen miRNA en gebruikt Oligo-dT met de universele sequentie als een reverse transcriptieprimer om de verlengde miRNA te synthetiseren die overeenkomt met de eerste streng van cDNA. De stem-loop-methode gebruikt de universele sequentie gevouwen in de stem-loop-structuur als een primer om de eerste streng van het cDNA te synthetiseren die overeenkomt met de verlengde miRNA. De stem-loop-structuur wordt geopend bij een geschikte temperatuur tijdens het daaropvolgende amplificatieproces en gecombineerd met de relevante amplificatieprimers.
Tabel 1.Vergelijking van Tailing en Stem-loop
| Categorie | Staart | Stam-lus |
| Toepasbaarheid | Geschikt voor het gelijktijdig bestuderen van meerdere verschillende miRNA's | Geschikt voor nauwkeurige kwantitatieve detectie van enkele miRNA's in een monster |
| Voordeel | Een enkele reverse transcriptie kan meerdere miRNA's met een hoge doorvoer detecteren | Er kan slechts één miRNA tegelijk worden gedetecteerd door middel van reverse transcriptie, met een sterke specificiteit |
| Systeem | Samen met de betrokken miRNA, reverse transcriptie in hetzelfde reactiesysteem met hoge nauwkeurigheid | Intern betrokken miRNA's worden in de twee systemen gescheiden en omgekeerd getranscribeerd, wat gevoelig is voor fouten |
| Specificiteit | ★★★★☆ | ★★★★★ |
| Gevoeligheid | ★★★★★ | ★★★★☆ |
| Tijd | ★★★★☆ | ★★★★★ |
2. Aanbevolen producten
2.1 Yeasen miRNA-staartinversie kwantitatieve combinatie (11148ES&11171ES)
Figuur 4. 11148ES-Hifair™ miRNA 1st Strand cDNA Synthesis Kit
De kit gebruikt de tailing-methode voor reverse transcriptie van miRNA first-strand cDNA. De 2×Hifair™ miRNA RT-buffer in het product bevat alle grondstoffen en primers voor miRNA tailing-reactie en reverse transcriptie-reactie, en is zorgvuldig geoptimaliseerd. Het kan ervoor zorgen dat de poly(A)-modificatie- en reverse transcriptieprocessen van het miRNA 3'-uiteinde efficiënt en gelijktijdig worden uitgevoerd.
Figuur 5. 11171ES -Hieff™ miRNA Universele qPCR SYBR Master Mix
Een nieuwe generatie van voorgemengde fluorescentie kwantitatieve PCR detectie reagentia speciaal ontwikkeld voor miRNA kwantitatieve detectie, met speciale ROX Passive Reference Dye, geschikt voor alle qPCR instrumenten, geen noodzaak om de concentratie van ROX aan te passen op verschillende instrumenten, alleen in de voorbereidingsreactie Amplificatie kan worden uitgevoerd door primers en templates toe te voegen aan het systeem. De DNA polymerase neemt chemisch gemodificeerde hot-start polymerase aan, en werkt samen met een speciaal buffersysteem, wat de reactie specificiteit en gevoeligheid hoger maakt, en nauwkeurig kan kwantificeren in een breder bereik.
2.2 Productprestaties
2.2.1 Compatibel met alle-platform qPCR-instrumenten
Figuur 6. Compatibele resultaten met verschillende qPCR-instrumenten
Met behulp van het totale RNA van 293T-cellen als template werd reverse transcriptie uitgevoerd met de Hifair™ miRNA 1st Strand cDNA Synthesis Kit (Cat.nr. 11148ES).Het verkregen cDNA werd 10-voudig verdund en vervolgens werd Hieff™ miRNA Universal qPCR SYBR Master Mix (Cat.nr. 11171ES) gebruikt om de interne referentiegenen van respectievelijk hsa-miR-let-7b-5p, hsa-miR-let-7c-5p en U6 te detecteren.
2.2.2 Hoge detectiegraad, tot 10 pg
Figuur 7. Amplificatieplot
Figuur 8. Amplificatieplot
Met behulp van synthetische hsa-miR-let-7e-5p(a) en 293T-cel totaal RNA(b) als templates, verdund tot de volgende gradiënten, respectievelijk: 60 kopieën tot 606 kopieën (6 gradiënten) en 10 pg-100 ng (5 gradiënten), omgekeerd getranscribeerd met Hifair™ miRNA 1st Strand cDNA Synthesis Kit (Cat.nr. 11148ES), en de resulterende cDNA werd gedetecteerd met Hieff™ miRNA Universal qPCR SYBR Master Mix (Cat.nr. 11171ES) voor hsa-miR-let-7e-5p genexpressie.
2.2.3 Hoge specificiteit, in staat om verschillen tussen enkele basen tussen miRNA's in dezelfde familie te onderscheiden
Figuur 9. Onderscheid de verschillen tussen miRNA's op basis van één enkele base
De menselijke hsa-let-7-familie heeft meerdere miRNA's, met weinig basen die van elkaar verschillen, of zelfs maar een enkel basenverschil. Synthetische miRNA's voor elke Let-7-isovorm (hsa-miR-let-7a~Let-7i, has-miR-98) werden omgekeerd getranscribeerd in cDNA met behulp van de Hifair™ miRNA 1st Strand cDNA Synthesis Kit (Cat# 11148ES), met behulp van Hieff™ miRNA Universal qPCR SYBR Master Mix (Cat# 11171ES) om deze miRNA's afzonderlijk te amplificeren met verschillende primers, en de match rate te berekenen met behulp van vergelijking 2-ΔCT x 100%. De resultaten laten zien dat nauw verwante subtypefamilieleden effectief kunnen worden onderscheiden.
2.2.4 Uitstekende versterkingsefficiëntie
Figuur 10. Versterkingsefficiëntie
Figuur 11. Versterkingsefficiëntie
miR-let-7b-5p, miR-let-7c-5p, miR-let-7e-5p, miR-let-7f-5p genen werden versterkt met behulp van humane 293T cellen en muizenlever Total RNA als templates. De resultaten toonden aan dat vergeleken met soortgelijke producten, Hifair™ miRNA 1st Strand cDNA Synthesis Kit (Cat# 11148ES) overeenkwam met het reactiesysteem van Hieff™ miRNA Universal qPCR SYBR Master Mix (Cat# 11171ES) met uitstekende prestaties.
2.2.5 Uitstekende stabiliteit
Figuur 12. Productstabiliteitsanalyse bij 37℃ gedurende 7 dagen
Figuur 13. Analyse van de resultaten na 50 vries-dooicycli
Figuur 14. Stabiele analytische eigenschappen van het kwantitatieve reactiesysteem bij verschillende temperaturen gedurende 24 uur
Omgekeerde transcriptie werd uitgevoerd met Hifair™ miRNA 1st Strand cDNA Synthesis Kit (Cat# 11148ES) met 293T-cel Total RNA als template, en het verkregen cDNA werd 10-voudig verdund en gedetecteerd met Hieff™ miRNA Universal qPCR SYBR Master Mix (Cat# 11171ES). Expressie van hsa-miR-let-7b-5p, hsa-miR-let-7c-5p, hsa-miR-let-7e-5p. △Ct<0,5.
2.3 Yeasen miRNA stam-lus inversie kwantitatieve combinatie (11139ES&11170ES)
Figuur 15. 11139ES-Hifair™ III 1e streng cDNA-synthesekit (gDNA-digestor plus)
De kit is ontwikkeld op basis van Hifair™ III Reverse Transcriptase.De enzym cDNA-synthesesnelheid is snel en de thermische stabiliteit is sterk verbeterd. Tegelijkertijd verbetert het enzym de affiniteit met de template en is het geschikt voor de reverse transcriptie van een kleine hoeveelheid templates en low-copy genen. Het vermogen van Hifair™ III Reverse Transcriptase om cDNA van volledige lengte te synthetiseren is ook verbeterd, waardoor de synthese van cDNA tot 19,8 kb mogelijk is.
Figuur 16. 11170ES-Hieff™ miRNA Universele qPCR SYBR Master Mix
Dit product is een speciale mastermix voor miRNA-kwantificering met behulp van de SYBR Green I chimere fluorescentiemethode. Omdat miRNA-sequenties kort zijn en miRNA-sequenties in dezelfde familie vaak sterk op elkaar lijken, is specificiteit extreem vereist tijdens kwantificering. Dit product is gebaseerd op hot-start DNA-polymerase, met geoptimaliseerde buffer, die niet-specifieke amplificatie aanzienlijk kan verminderen; tegelijkertijd maakt de speciale ROX Reference Dye de mastermix geschikt voor alle qPCR-instrumenten en is het niet nodig om ROX op verschillende instrumenten aan te passen. Amplificatie kan worden uitgevoerd door primers en sjablonen toe te voegen bij het voorbereiden van het reactiesysteem.
2.3.1 Compatibel met alle-platform qPCR-instrumenten
Figuur 17. Compatibele resultaten met verschillende qPCR-instrumenten
Met behulp van totaal RNA van muizenlevercellen als template werd reverse transcriptie uitgevoerd met Hifair™ III 1st Strand
cDNA Synthesis Kit (gDNA digester plus) (Cat.nr. 11139ES), en het verkregen cDNA werd 40-voudig verdund en gebruikt. Hieff™ miRNA Universal qPCR SYBR Master Mix (Cat.nr. 11170ES) werd gebruikt om het menselijke mmu-miR-125a-gen te amplificeren.
2.3.2 Hoge gevoeligheid, tot 10 pg
Figuur 18. Gevoeligheidsdetectie
Met behulp van totaal RNA van muizenlevercellen als template werd reverse transcriptie uitgevoerd met Hifair™ III 1st Strand cDNA Synthesis Kit (gDNA digester plus) (Cat.nr. 11139ES), en werd het verkregen cDNA serieel 10-voudig verdund (bereik 10 pg/μL). -0,1 μg/μL), om de genen mmu-miR-125a, mmu-miR-132 en mmu-miR-351 van muizenoorsprong te versterken.
2.3.3 Hoge specificiteit, in staat om verschillen tussen enkele basen tussen miRNA's in dezelfde familie te onderscheiden
Figuur 19. Onderscheid de verschillen tussen miRNA's op basis van één enkele base
De menselijke hsa-let-7-familie heeft meerdere miRNA's, met weinig basen die van elkaar verschillen, of zelfs maar een enkel baseverschil. Deze miRNA's werden afzonderlijk versterkt met verschillende primers met behulp van Hieff™ miRNA Universal qPCR SYBR Master Mix (Cat# 11170ES), en de matching rate werd berekend met behulp van de formule 2^-Δct x 100%.
2.3.4 Goede herhaalbaarheid
Figuur 20. Detectie van herhaalbaarheid
Met behulp van het totale RNA van menselijke 293T-cellen als template voor reverse transcriptie werd reverse transcriptie uitgevoerd met Hifair™ III 1st Strand cDNA Synthesis Kit (gDNA digester plus) (Cat.nr. 11139ES). Het verkregen cDNA werd 50-voudig verdund en gebruikt. Hieff™ miRNA Universal qPCR SYBR Master Mix (Cat.nr. 11170ES) werd gebruikt om het menselijke hsa-let-7a-gen te amplificeren in een 90-wells replicaat-experiment.
2.3.5 Goede stabiliteit
Figuur 21.Stabiliteitsanalyse van 11170ES bij verschillende temperaturen gedurende 14 dagen
Figuur 22. Analyse van herhaald invriezen en ontdooien van 11170ES
Figuur 23. Stabiele analyse-eigenschappen van het kwantitatieve reactiesysteem bij verschillende temperaturen gedurende 24 uur
Het totale RNA van muizenlevercellen werd gebruikt als template voor reverse transcriptie met Hifair™ III 1st Strand cDNA Synthesis Kit (gDNA digester plus) (Cat# 11139ES). Het verkregen cDNA werd 100-voudig verdund om het murine mmu-miR-132-gen te amplificeren.
3. Gerelateerde productlijst
Tabel 2. Gerelateerde productlijst