Directe PCR is een reactie die direct bloed, dierlijk of plantaardig weefsel, etc. gebruikt voor amplificatie zonder stappen voor nucleïnezuurextractie en nucleïnezuurzuivering. Het brengt ongekend gemak voor DNA-amplificatie, wat veel tijd kan besparen. Dus wat zijn de reagentia en producten die worden gebruikt bij directe PCR?

1. Wat is directe PCR?
2. Welke reagentia zijn nodig voor directe PCR
3. Toepassingsscenario's en kenmerken van de Direct PCR Kit
4. Productgegevens
5. Feedback van klanten
6. Informatie over het bestellen van producten

1. Wat is directe PCR?

Na voortdurende aanvulling en verbetering door talloze geleerden over de hele wereld, is PCR-technologie de meest gebruikte, meest gebruikte en belangrijkste basisonderzoeksmethode in het hele veld van de levenswetenschappen geworden. Touch Down PCR, RT-PCR, Real-Time PCR, Multi PCR, enz., ontwikkeld op basis van de brede toepassing van traditionele PCR-technologie, evenals de nieuwste Digital PCR (Digital PCR), hebben het onderzoek van de meeste wetenschappelijke onderzoekers enorm verrijkt. Deze methoden hebben de ontwikkeling van moderne levenswetenschappen, met name moleculaire biologie, enorm versneld en grote bijdragen geleverd aan het onderzoek naar leven en natuur voor de hele mens. Traditionele PCR-technologie en verschillende nieuwe technologieën en nieuwe toepassingen die daaruit zijn afgeleid, hebben een vereiste, dat wil zeggen dat er vooraf zeer zuivere nucleïnezuursjablonen moeten worden verkregen. Elk biologisch monster moet een reeks complexe en vervelende monsterverwerkingen doorlopen om nucleïnezuurmonsters te verkrijgen die voldoen aan de technische vereisten van PCR. De scheiding en extractie van DNA en RNA zijn altijd het basiswerk geweest dat relevant wetenschappelijk en technisch personeel elke dag moet herhalen. Vanwege het enorme verschil tussen monsters is het scheidings- en extractieproces van DNA en RNA ook heel anders. Dit werk vereist een hoog niveau van technische bekwaamheid van operators. Vanwege het gebruik van enkele zeer giftige chemische reagentia in de traditionele scheidings- en extractietechnologie, zal langdurige blootstelling onomkeerbare schade aan het lichaam van de operator veroorzaken en zelfs directe schade veroorzaken tijdens het experiment. Chemische reagentia zoals fenol en chloroform zijn belangrijke kankerverwekkende stoffen in het laboratorium en de vloeibare stikstof die wordt gebruikt in het proces van scheiding van nucleïnezuur en extractie van plantenweefsels vormt een grotere bedreiging voor de veiligheid van operators tijdens het experiment vanwege de ultralage temperatuur. Tegelijkertijd is het scheiden en extraheren van nucleïnezuren een arbeidsintensieve taak voor degenen die een groot aantal monsters moeten bestuderen. Nu zijn de isolatie- en extractiekits voor nucleïnezuur op de markt volwassen en zijn er veel merken, maar ze zijn allemaal ongeveer hetzelfde. Of het nu gaat om een ​​centrifugale kit met silicamembraankolom of een kit met magnetische kralenmethode, er is veel tijd nodig en de kosten zijn hoog. Naast de kosten van de kit zijn er speciale vereisten voor laboratoriumapparatuur. Het geautomatiseerde werkstation dat wordt gebruikt in de magnetische kralenmethode is een zeer typische grootschalige, hoogwaardige apparatuur, die een enorme uitgave is voor het laboratorium. Samenvattend, voor het uitvoeren van PCR-experimenten is monstervoorbehandeling een onvermijdelijke en constante hoofdpijn voor onderzoekers. Hoe dit probleem op te lossen en direct PCR-experimenten uit te voeren zonder scheiding en extractie van nucleïnezuren is altijd een probleem geweest waar veel wetenschappelijke onderzoekers en klinisch laboratoriumpersoneel over hebben nagedacht.

Directe PCR is een reactie waarbij dierlijke of plantaardige weefsels direct worden gebruikt voor amplificatie zonder extractie van nucleïnezuur. In veel opzichten werkt directe PCR als conventionele PCR.Het belangrijkste verschil is de aangepaste buffer die wordt gebruikt bij directe PCR. Het monster kan direct worden onderworpen aan een PCR-reactie zonder extractie van nucleïnezuur, maar er zijn overeenkomstige vereisten voor de tolerantie van de enzymen die betrokken zijn bij de directe PCR-reactie en de compatibiliteit van de buffer. Hoewel er meer of minder PCR-remmers in gangbare monsters zitten, kan directe PCR nog steeds betrouwbare amplificatie bereiken onder invloed van enzymen en buffers. De traditionele PCR-reactie moet echter hoogwaardig nucleïnezuur gebruiken als template voor de reactie. Als de template eiwitten en andere onzuiverheden bevat, zal het de vlotte voortgang van de PCR-reactie belemmeren.

Het vroegste toepassingsgebied van directe PCR is het gebied van dieren en planten, zoals bloed, weefsel en haar van muizen, katten, kippen, konijnen, schapen, runderen en andere dieren; bladeren en zaden van planten, enz. Het wordt gebruikt om genotypering, transgene, plasmidedetectie, gen-knockoutanalyse, DNA-bronidentificatie, soortidentificatie, SNP-analyse en andere gebieden te bestuderen. Deze gebieden hebben enkele gemeenschappelijke kenmerken, dat wil zeggen dat de inhoud van het doelgen relatief hoog is en dat de extractie van nucleïnezuur lastig is. Daarom kan directe PCR niet alleen tijd besparen en weinig impact hebben op de resultaten, maar ook kosten besparen.

2. Welke reagentia zijn nodig voor directe PCR

2.1 Monsterlysaat

Het monsterlysaat kan door uzelf worden bereid of worden gekocht. Het verschil in de componenten van verschillende merken lysaat zal ervoor zorgen dat het lysingvermogen anders is, en dan zal de lysingtijd iets anders zijn. Bijvoorbeeld, voor de bereiding van dierlijke weefselmonsters wordt over het algemeen aanbevolen om 30 minuten of een nacht te lyseren, en het lysaat voor virussen varieert van 3-10 minuten.

2.2 PCR-mastermix

Het wordt aanbevolen om een ​​hot-start DNA-polymerase te gebruiken om specifieke amplificatie en sterker amplificatievermogen te verbeteren. De kern van directe PCR is een zeer resistente polymerase.

2.3 Verwijder of rem componenten in monsters die de DNA-amplificatie beïnvloeden

Nadat het monster door het lysaat is verwerkt, worden eiwitten, lipiden en ander celafval vrijgegeven en deze stoffen remmen de PCR-reactie. Daarom moet directe PCR overeenkomstige verwijdering of remmers toevoegen om de invloed van deze factoren te verminderen.

3. Toepassingsscenario's en kenmerken van de Direct PCR Kit

Directe PCR-kit van Yeasen kan de monsters van de plant, het dierlijk weefsel of het bloed en andere originele monsters direct versterken zonder zuivering van nucleïnezuur, wat het experimentele PCR-proces aanzienlijk vereenvoudigt. PCR-gebaseerde genotypering (Figuur 1) werd uitgevoerd met behulp van het originele monster zonder genoomzuivering (Figuur 1A) of met behulp van het lysaat (Figuur 1B) als sjabloon. Vergeleken met algemene PCR-gebaseerde genotypering heeft de directe PCR-kit minder monsterverbruik, eenvoudige bediening, lage experimentele kosten en kwantitatieve monsterdetectie van hoge kwaliteit.

Figuur 1. Directe PCR-technologie.

A. Directe methode: Neem een ​​klein aantal monsters en voeg ze direct toe aan de PCR-mix voor PCR-identificatie. B. Lysismethode: Voeg het monster toe aan de lysisoplossing om het genoom vrij te maken en voeg een kleine hoeveelheid van de lysissupernatant toe aan de PCR-mix voor PCR-identificatie.

3.1 Toepassingen

Detectie van dierlijke genamplificatie, genotypering van transgene dieren, identificatie van transgene planten, genotypering van planten, enz.

3.2 Kenmerken

★   Direct: geen DNA-zuivering;
★   Snel: 10 min om de templatevoorbereiding te voltooien, 50 min om de PCR-reactie te voltooien;
★   Eenvoudig: Monsters kunnen worden gelyseerd zonder te schuiven of te malen;
PCR-mix heeft de vorm van een mastermix, waardoor het aantal stappen voor het toevoegen van monsters wordt verminderd
★   Besparing: minder materiaalverbruik
★   Hoge doorvoer: lysisreactie kan worden voltooid in een 96-wells plaat
★   Sterke remmertolerantie

4. Productgegevens

4.1 Universeel type voor meerdere dieren: Animal Tissue Direct PCR Kit

4.1.1 Snelst: verkort de bedrijfstijd

Figuur 2. Een directe PCR-kit voor dierlijk weefsel van Yeasen zou meer tijd kunnen besparen.

4.1.2 Voorbeeld: Genotype-identificatie van knockoutmuizen

Figuur 3. De resultaten van directe amplificatie van dierlijk weefsel met behulp van een directe PCR-kit voor de detectie van gen-knockout bij dieren.

M: 100bp DNA-ladder. Banen 1-8: lysaat als template. +: 50 ng Gezuiverd genomisch DNA als template. ﹣: Gedemineraliseerd water als template. Meerdere cycli: 35 cycli. Enkel fragment (580bp): Knockout dierlijk homozygoot genoom. Enkel fragment (180bp): Wildtype genoom. Twee fragmenten (580bp/180bp): Knockout dierlijk heterozygoot genoom.

4.2 Knaagdierspecifiek: Muisweefsel Direct PCR Kit

4.2.1 Sneller: Voldoende genvrijgave

Figuur 4 Resultaten van directe amplificatie van een directe PCR-kit voor muizenweefsel met verschillende lysistijden.

M: 100bp DNA-ladder. +: 50 ng gezuiverd genomisch DNA als template. Meerdere cycli: 35 cycli.

4.2.2 Beter dan de algemene alkalische lysismethode

Figuur 5. Resultaten van de SOX21-genamplificatie van een muizenstaart die behandeld is met verschillende lysismethoden.

M: 100 bp DNA-ladder. Banen 1-2: Lysaat als template door algemene alkalische lysis. Banen 3-4: Lysaat als template door muisweefsel direct PCR-kit. +: 50 ng gezuiverd genomisch DNA als template. -: Gedemineraliseerd water als template. Meerdere cycli: 35 cycli.

4.2.3 Vergelijk met soortgelijke producten

Figuur 6. Resultaten van de SOX21-genamplificatie van muizenstaarten die behandeld zijn met soortgelijke producten van verschillende merken.

M: 100 bp DNA-ladder. +: 50 ng gezuiverd genomisch DNA als template. Meerdere cycli: 35 cycli.

4.3 Plantenweefsel Direct PCR Kit

4.3.1 Verificatie van multi-type plantenmonsters

Figuur 7. Resultaten van directe amplificatie van bladeren van verschillende planten.

M: 100 bp DNA-ladder. C: Het gezuiverde genomische DNA als sjabloon.Lanes 1-2: Het bladweefsellysaat als template. Meerdere cycli: 30 cycli.

5. Feedback van klanten

5.1 Genotypering van muizen

Figuur 8. De resultaten van identificatie van het muizengenotype met behulp van een directe PCR-kit voor muizenweefsel door gebruikers van Beijing Jishi Life Technology Co., Ltd.

5.2 Rijst directe PCR

Figuur 9. Amplificatie van rijstgerelateerde genen met behulp van directe PCR-kits voor plantenweefsel door gebruikers van de Huazhong Agricultural University.

6. Informatie over het bestellen van producten

Yeasen is een biotechnologisch bedrijf dat zich bezighoudt met onderzoek, ontwikkeling, productie en verkoop van drie belangrijke biologische reagentia: moleculen, eiwitten en cellen. De producten die worden geleverd door Yeasen zijn als volgt.

Tabel 1. Productbestelinformatie