De kit is uitgerust met een krachtige lysisbuffer, die snel monsters kan lyseren (bijv. cellen, muizenstaart, muizenoor, muizenteen, spieren, enz.) om genomisch DNA vrij te maken, en het lysaat kan direct worden toegevoegd aan het PCR-reactiesysteem zonder zuivering, wat handig is voor de werking. Bovendien vereist deze kit een lage monsterinvoer, 5 mg muizenweefsel of 1-5 mm muizenstaart kan worden gebruikt voor experimenten.

Componenten

Opslag

19697-A (Lysisoplossing) moet worden bewaard bij 2~8℃ voor 1 jaren. Indien u het product meerdere keren gebruikt, kunt u het het beste in aparte verpakkingen invriezen om kruisbesmetting te voorkomen. 19687-B (Stopoplossing) moet worden opgeslagen bij -25~-16℃ voor 1 jaren.

Instructies

Vrijgave van muisgenomisch DNA

1. Knip 5-10 mg dierlijk weefsel of 1-5 mm muizenstaart af in een centrifugebuis van 1,5 ml*.
2. Voeg 90 μL Buffer ML toe aan de bovenstaande centrifugebuis, vortex voorzichtig totdat het monster volledig is geïnfiltreerd met het lysaat en centrifugeer kort.
3. Incubeer gedurende 15 min bij 95°C in een thermostatische broedstoof**.
4. Voeg 10 μL Buffer MT toe, schud om te mengen en beëindig de lysis.
5. Optionele stap: centrifugatie bij 12.000 tpm gedurende 2 min.
6. Breng de supernatant over naar een nieuwe centrifugebuis en bewaar deze bij 4°C of -20°C. U kunt de supernatant ook direct gebruiken voor PCR-amplificatie.

* Het weefsel moet zoveel mogelijk in stukken worden gesneden, zodat de lysisreactie soepeler verloopt.

**Incubatie bij 95°C gedurende 15 min is over het algemeen voldoende voor de meeste PCR-behoeften. Als een grotere hoeveelheid DNA nodig is of het monster moeilijk te lyseren is, kan de tijd worden verlengd tot 30 min. Het weefselblok hoeft niet volledig te worden gelyseerd en het residu kan worden verwijderd in een volgende centrifugatiestap.

Vrijgave van celgenoom-DNA

Na het kweken van getransfecteerde cellen in een 48-wells plaat gedurende 3 dagen en het bereiken van een celdichtheid van ongeveer 70.000 cellen/well, verwijder het medium zo volledig mogelijk. Voeg vervolgens 90 ul ML buffer direct per well toe en pipetteer elke well. Breng alles over naar de 96-wells PCR plaat. Na behandeling met een PCR machine bij 95 °C gedurende 5-15 min en afkoeling, voeg 10 ul MT buffer toe en blaas gelijkmatig en grondig. Voeg met behulp van high-fidelity enzym (Cat# 10164) of Taq enzym 0,5-2 ul cellysaat toe aan elke 50 ul PCR reactiesysteem en voer PCR uit.

Figuur 1. Directe PCR met cellysaat behandeld met 19697.

Notities

1. Dit product is uitsluitend bedoeld voor onderzoeksdoeleinden.
2. Voor uw eigen veiligheid dient u een veiligheidsbril, een labjas en wegwerphandschoenen te dragen.
3. Om kruisbesmetting tussen monsters te voorkomen, is het noodzakelijk om de rand van het monsternameapparaat of het deel dat in direct contact staat met het monster na elke monstername onder te dompelen in een 2% natriumhypochlorietoplossing, het apparaat meerdere keren te wassen en de resterende vloeistof vervolgens te drogen met een schone papieren handdoek voordat u het apparaat opnieuw gebruikt.Voor het gemak van de test kunnen meerdere monsternameapparaten worden voorbereid en na gebruik gelijkmatig worden gereinigd. Zo wordt gegarandeerd dat elk afzonderlijk monster wordt genomen met een monsternameapparaat dat vrij is van besmetting.
4. Het wordt aanbevolen om vers genomen dierlijke weefsels te gebruiken. In het geval van langdurig ingevroren weefsels, moet herhaaldelijk invriezen en ontdooien zoveel mogelijk worden vermeden, anders zal het leiden tot degradatie van de template en de PCR-efficiëntie beïnvloeden.

Documenten:

Handleidingen