Doorbraakprestatie van Yeasen en Molefuture biotechnologie
Met de snelle ontwikkeling van biotechnologie heeft mRNA-therapie, als opkomende behandelmethode, veel aandacht getrokken vanwege de sterke programmeerbaarheid en snelle responssnelheid. Op gebieden zoals mRNA-vaccins en gentherapie is efficiënte synthese van hoogwaardig mRNA een cruciale stap in het bereiken van therapeutische doelen. In dit proces speelt T7 RNA-polymerase een cruciale rol, omdat het de in vitro-synthese van mRNA efficiënt kan katalyseren.
Het dsRNA-bijproductprobleem van T7 RNA-polymerase
Hoewel T7 RNA polymerase een belangrijke rol speelt in de mRNA synthese, resulteert de daadwerkelijke werking vaak in de productie van dubbelstrengs RNA (dsRNA) als bijproduct. De aanwezigheid van dsRNA vermindert niet alleen de opbrengst en zuiverheid van mRNA, maar kan ook niet-specifieke immuunreacties triggeren, wat de werkzaamheid en veiligheid beïnvloedt. Daarom is het verminderen van de productie van dsRNA een dringende behoefte geworden in de industrie. Methoden om dsRNA te reduceren bestaan momenteel voornamelijk uit het optimaliseren van reactieomstandigheden en het gebruiken van hulpenzymen. Hoewel deze methoden de productie van dsRNA tot op zekere hoogte kunnen reduceren, brengen ze vaak problemen met zich mee, zoals complexe werking en hogere kosten.
Waarom zouden we T7 RNA-polymerase-engineering moeten toepassen?
Het direct modificeren van T7 RNA polymerase om dsRNA productie te verminderen is een meer fundamentele oplossing. Enzym-gerichte evolutietechnieken kunnen de katalytische eigenschappen verbeteren en de zuiverheid en opbrengst van producten verhogen door de aminozuursequentie of -structuur van het enzym nauwkeurig te veranderen. Voor T7 RNA polymerase kan gerichte modificatie niet alleen de dsRNA productie verminderen, maar ook de algehele efficiëntie en kwaliteit van mRNA synthese verbeteren.
Als leverancier van grondstoffen voor mRNA-in-vitrosynthese,
Hoe ontstaat dsRNA?
Volgens literatuurrapporten is de productie van het bijproduct dsRNA voornamelijk afkomstig van twee bronnen (Figuur 1): De eerste is tijdens de overgang van T7 RNA-polymerase van de initiatieconformatie naar de verlengingsconformatie in de vroege stadia van transcriptie, het transcriptie-ternaire complex is vatbaar voor dissociatie [1], wat resulteert in de vrijgave van een groot aantal korte RNA-ketens (Abortive RNA) met lengtes rond de 20 nt in het systeem. Deze RNA-ketens fungeren als "primers", complementaire paring met lange RNA-ketens, en strekken zich uit om dsRNA te produceren onder de werking van de RNA-afhankelijke RNA-polymerase-activiteit van T7 RNA-polymerase (RDRP-activiteit) [2,3]. De tweede bron wordt geactiveerd door de terminale ribonucleotide-overdrachtsactiviteit van T7 RNA-polymerase. Wanneer de transcriptiereactie het einde van de lineaire template bereikt, kan T7 RNA-polymerase willekeurig meerdere ribonucleotiden toevoegen zonder template-afhankelijkheid. Deze ribonucleotiden, die "willekeurige primers" vormen, kunnen omgekeerd vouwen en complementair paren met de doel-mRNA-regio, en zich uitbreiden om dsRNA te produceren. De dsRNA die wordt geproduceerd door looping wordt loopback-dsRNA genoemd [3,4]. Om dsRNA-bijproducten te verminderen, ligt de focus van T7 RNA-polymerasemodificatie daarom op het stabiliseren van het vroege transcriptie-ternaire complex of het verzwakken van de terminale overdrachtsactiviteit en RNA-afhankelijke RNA-polymerase (RDRP). activiteit van T7 RNA-polymerase.
Figuur 1. Schematisch diagram van energiebarrière en dsRNA-vormingsprincipe (ongepubliceerde gegevens)
Hoe te overwinnen energiebarrière van T7 RNA-polymerase conformationele overgang?
Door middel van structurele en vrije energieanalyse ontdekte het team enerzijds dat er naast de conformationele veranderingen van T7 RNA-polymerase ook een verandering in energie is. De vrije energie van de verlengingsconformatie is aanzienlijk hoger dan die van de initiatieconformatie, wat aangeeft dat het transcriptieproces een hogere energiebarrière moet overwinnen om complete mRNA-ketens te produceren. Een hoge energiebarrière is ongunstig voor een soepele conformationele overgang. Daarom gebruikte het team rationeel screeningmethoden om meer dan 20 hotspot-aminozuren te identificeren en bijbehorende verzadigingsmutagenesebibliotheken te construeren.
Hoe de terminale overdracht en RDRP-activiteiten van T7 RNA-polymerase
Aan de andere kant, gezien de beperkte rapporten over de functies, sites en structurele domeinen gerelateerd aan de terminale transfer en RDRP-activiteiten van T7 RNA-polymerase, en omdat deze twee activiteiten, die functioneel vergelijkbaar zijn, waarschijnlijk belangrijke sites delen met de hoofdreactie van T7 RNA-polymerase—transcriptieactiviteit (d.w.z. DNA-afhankelijke RNA-polymerisatieactiviteit, DDRP)—is het moeilijk om hotspot-aminozuren te vinden voor site-gerichte modificatie. Daarom construeerde het team gelijktijdig meerdere willekeurige mutatiebibliotheken op basis van foutgevoelige PCR, gecombineerd met de high-throughput evolutiecapaciteit van het ZymeEditor-platform, wat resulteerde in een diversiteit van meer dan 10^6 voor elke individuele bibliotheek.
Op sonde gebaseerde ontdekking van ideaal T7 RNA-polymerase
Om de productie van T7 RNA-polymerase in evenwicht te brengen en de inhoud van dsRNA in de in vitro transcriptiereactie te monitoren, heeft het team, met verwijzing naar geoptimaliseerde transcriptiesjablonen, zorgvuldig meerdere fluorescerende probes die zich richten op verschillende regio's van de doel-mRNA-producten. Deze probes associëren informatie zoals reactieopbrengst, integriteit en dsRNA-inhoud binnen het systeem met fluorescentiesignalen. Hoe sterker de fluorescentie-intensiteit van het systeem, hoe voordeliger de prestatie van de mutant. In theorie kan deze screeningmethode mutanten rangschikken op basis van de fluorescentie-intensiteit van verschillende probes, waardoor T7 RNA-polymerasemutanten met een hoge opbrengst of verminderde abortieve RNA worden verkregen, evenals mutanten met verbeterde integriteit of verminderde loopback-dsRNA. Wanneer de reactietemplate wordt vervangen door RNA, kunnen mutanten met verminderde RDRP-activiteit ook negatief worden gescreend, waardoor de templateselectiviteit van T7 RNA-polymerase wordt verbeterd. Bovendien kan door het toevoegen van gemodificeerde nucleotiden, cap-analogen en het verhogen van de reactietemperatuur in het druppelreactiesysteem, verdere screening worden uitgevoerd om T7 RNA-polymerasemutanten te selecteren die niet-natuurlijke substraten tolereren en een verbeterde thermische stabiliteit vertonen.
Hoe je het beste kunt screenen T7 RNA-polymerase?
Op basis van de omvang van de bibliotheken is het team ontwikkelde screeningprocessen met een ultrahoge doorvoer op basis van fluorescentie-geactiveerde druppelsortering (FADS) en screeningprocessen met een hoge doorvoer op basis van traditionele microtiterplaatmethoden (MTPS).Door middel van meerdere rondes van experimenten werden in totaal meer dan 10^7 mutanten gescreend, wat resulteerde in meerdere mutanten met een significant verlaagd dsRNA-gehalte. Sommige mutanten vertoonden een afname in dsRNA veroorzaakt door Abortive RNA in de reactie, wat suggereert dat de elongatieconformatie van deze polymerasemutanten stabieler is. Sommige mutanten vertoonden een afname in loopback dsRNA-gehalte in de reactie, wat duidt op een verzwakking van terminale transferactiviteit of RDRP-activiteit in deze mutanten.
Aangezien de prestatievoordelen van de bovengenoemde mutanten voortkomen uit verschillende mechanismen, heeft het team heeft DNA-shufflingbibliotheken geconstrueerd die op hen gericht zijn. Na screening heeft het team uiteindelijk superieur presterende mutanten verkregen met extreem lage dsRNA-generatie zonder de opbrengsten en mRNA-integriteit te beïnvloeden (Figuur 2). De opbrengsten van een mutant G47A+884G ontdekt door Moderna werden echter beïnvloed[5] (niet gepubliceerd).
Figuur 2. Enzym-evolutieproces en karakterisering van mutantprestaties
(niet gepubliceerd)
Analyse van dsRNA-generatie door T7 RNA-polymerase varianten?
Na kwantitatieve analyse, zoals weergegeven in Figuur 3, met behulp van een 9 kb transcriptiesjabloon onder co-transcriptie capping-omstandigheden, produceerde de wildtype T7 RNA-polymerase ongeveer 2,9 ng/μg dsRNA bij gebruik van natuurlijke nucleotiden, terwijl een commerciële T7-enzym produceerde ongeveer 0,18 ng/μg dsRNA. De dsRNA-productie van elke T7 RNA-polymerasevariant geconstrueerd was minder dan 0,10 ng/μg. In het bijzonder één variant was slechts 0,015 ng/μg, bijna 200 keer lager dan het wilde type en 12 keer lager dan het commerciële product. Na herhaalde tests werd het prestatievoordeel van de varianten bij het reduceren van dsRNA consistent waargenomen onder verschillende reactieomstandigheden, wat duidt op een goede systeemcompatibiliteit van deze mutanten en een basis legt voor verdere reductie van dsRNA-productie via reactiebuffer optimalisatie. Bovendien heeft FADS-screening ook meerdere varianten met verbeterde productintegriteit en thermische stabiliteit verkregen, die kunnen voldoen aan de vereisten van een breder scala aan in vitro transcriptietoepassingen
Figuur 3. Evaluatie van dsRNA-generatie door T7 RNA-polymerasevarianten beoordeeld met behulp van de
Momenteel hebben meerdere partners de T7 RNA-polymerasevarianten al uitgeprobeerd en wij hebben veel lof van hen ontvangen. Het gebruik van het nieuwe enzym vereenvoudigt het mRNA-zuiveringsproces, verbetert de werkefficiëntie en levert uitstekende prestaties in meerdere toepassingsscenario's.
Over Molefuture Biotechnologie
Molefuture Biotechnology is een dochteronderneming van
Bestel Informatie
Hieronder staan representatieve producten die worden aangeboden door
Over het lezen:
Referenties: