Het validatierapport van de dubbelstrengige RNA (dsRNA) ELISA-kit delen om de standaardisatie van dsRNA-detectie te bevorderen.

Bent u op zoek naar een betrouwbare manier om rest-dsRNA te detecteren tijdens mRNA in vitro transcriptie? Zoek niet verder dan The Double-stranded RNA (dsRNA) ELISA Kit. Echter, met verschillende commerciële kits beschikbaar, is het belangrijk om op te merken dat validatiegegevens mogelijk niet altijd openbaar beschikbaar zijn, wat leidt tot inconsistentie in dsRNA-detectie. Daarom delen we ons validatierapport van The Double-stranded RNA (dsRNA) ELISA Kit, dat specificiteit, precisie, nauwkeurigheid, gevoeligheid en duurzaamheid behandelt. Dit rapport dient als referentiegids om dsRNA-restdetectiemethoden te valideren die zijn afgestemd op specifieke experimentele omstandigheden en wettelijke farmacopeenormen. Lees meer over ons validatierapport om de standaardisatie van dsRNA-detectie te bevorderen.

Dubbelstrengs RNA (dsRNA) ELISA IkHet

Achtergrond:

De Double-stranded RNA (dsRNA) ELISA Kit is een reagenskit die is ontworpen om de residuale dsRNA te detecteren die wordt geproduceerd tijdens het mRNA in vitro transcriptieproces. Door gebruik te maken van het experimentele principe van de double antibody sandwich enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) en het biotin-streptavidin amplificatiesysteem, biedt deze kit gevoelige detectie van residuale dsRNA in monsters.

De samenvattingsgegevens bevatten validatieparameters die betrekking hebben op specificiteit, precisie, nauwkeurigheid, gevoeligheid en duurzaamheid. Het rapport fungeert als een naslaggids en spoort gebruikers aan om dsRNA-residudetectiemethoden te valideren die zijn afgestemd op hun specifieke experimentele omstandigheden en die voldoen aan de wettelijke farmacopeenormen.

Materialen en methoden:

Pakket: Dubbelstrengs RNA (dsRNA) ELISA-kit: Cat#36717ES (Yeasen). De kit bevat vier verschillende typen dsRNA-standaardmonsters. Gebruikers hebben de mogelijkheid om het standaardmonstertype te kiezen dat aansluit bij hun specifieke proces voor het genereren van de standaardcurve, waardoor de noodzaak om alle monsters voor te bereiden en te testen wordt vermeden.

Methoden: De materialen en procedurele stappen die essentieel zijn voor het experiment worden voornamelijk gespecificeerd door Yeasen Biotechnologie. De kit is uitgebreid getest en geëvalueerd, wat ervoor zorgt dat de prestaties voldoen aan de gestelde eisen van ICH Q2(R1) en de editie 2020 van de Chinese Pharmacopoeia Part Four "9101 Analytical Method Validation Guidelines".

Resultaten

  1. Lineariteit van dsRNA-normen

Dit rapport heeft standaardcurven ontwikkeld voor alle vier verschillende typen dsRNA-standaarden, elk met een lengte van 300 bp. Deze standaarden omvatten STD1, ongemodificeerde dsRNA; STD2, pseudo-UTP-gemodificeerde dsRNA; STD3, N1-Me-pseudo-UTP-gemodificeerde dsRNA; en STD4, 5-OMe-UTP-gemodificeerde dsRNA. Elk type dsRNA-standaard vertoont een uitstekende lineariteit van verdunning met R2 > 0,99 en een variatiecoëfficiënt (CV) van gemeten concentratie van minder dan 10%, zoals weergegeven in Tabel 1 tot Tabel 5.

Naam van de soa

UTP-type

Lineariteit van verdunning (R2＞0,99)

CV

SOA 1

UTP

0.0156-1 pg/μL

＜10%

SOA2

pUTP

0,0156-1 pg/μL

＜10%

SOA3

N1-Me-pUTP

0,0312-1 pg/μL

＜10%

SOA4

5-OMe-UTP

0,0625-1 pg/μL

＜10%

Tabel 1. De lineariteit van verschillende dsRNA-standaarden.

STD1-concN. (pg/μL)

Gemeten gemiddelde (pg/μL)

Herstel

CV

1

1.0001

100,0%

3,1%

0,5

0,4994

99,9%

2,4%

0,25

0,2516

100,7%

3,3%

0,125

0,1227

98,1%

0,5%

0,0625

0,0640

102,5%

3,2%

0,0312

0,0309

99,2%

1,3%

0,0156

0,0157

100,4%

3,2%

0

/

/

/

Tabel 2.Het herstel en CV van verdunde STD1

STD2-concN. (pg/μL)

Gemeten gemiddelde (pg/μL)

Herstel

CV

1

1.0001

100,0%

0,7%

0,5

0,4994

99,9%

0,1%

0,25

0,2514

100,6%

0,9%

0,125

0,1232

98,6%

2,5%

0,0625

0,0635

101,6%

1,1%

0,0312

0,0312

99,9%

0,5%

0,0156

0,0155

99,6%

0,0%

0

/

/

/

Tabel 3. Het herstel en de CV van verdunde STD2

STD3-verbinding (pg/μL)

Gemeten gemiddelde (pg/μL)

Herstel

CV

2

2.0031

100,2%

1.6%

1

0,9880

98,8%

2,4%

0,5

0,5188

103,8%

1,2%

0,25

0,2383

95,3%

2,2%

0,125

0,1242

99,4%

0,1%

0,0625

0,0629

100,7%

1,8%

0,0312

0,0361

115,7%

1,6%

0

/

/

/

Tabel 4. Het herstel en de CV van verdunde STD3

STD4-verbinding (pg/μL)

Gemeten gemiddelde (pg/μL)

Herstel

CV

4

4.0096

100,2%

1,9%

2

1.9940

99,7%

0,7%

1

0,9977

99,8%

0,1%

0,5

0,5108

102.2%

0,1%

0,25

0,2454

98,2%

5,6%

0,125

0,1207

96,5%

2,8%

0,0625

0,0624

99,9%

0,3%

0

/

/

/

Tabel 5. Het herstel en de CV van verdunde STD4

  1. Specificiteit

  • Specificiteitsanalyse met dsRNA, ssRNA, dsDNA en ssDNA.
Figuur 1. De kit identificeert uitsluitend dsRNA en detecteert geen ssRNA, dsDNA of ssDNA.

  • De specificiteit werd niet beïnvloed door de lengte van dsRNA's.
Figuur 2. De specificiteit van de kit blijft consistent over dsRNA's met verschillende lengtes (160 bp en 500 bp).

  1. Anauwkeurigheid

Toevoegen van 0,5 pg/μL STD1 aan een bekend mRNA-monster met een dsRNA-gehalte van 0,36 pg/μL werd uitgevoerd in drie verschillende volumeverhoudingen (1:1, 1:20, 1:250). In alle gevallen vielen de spike-herstelpercentages binnen het bereik van 80-120%.

Het spikeherstelpercentage wordt als volgt berekend: Spike Herstel Tarief=(gemeten concentratie na spiken×Totaal volume van gespikkeld monster-gemeten concentratie van de voorbeeld×Totaal volume van de voorbeeld)/(Theoretisch concentratie van de piek×Volume van de piek)×100%

Voorbeelden

Volumeverhouding van STD1/monster

Gemeten dsRNA (pg/μL)

Spike Herstel Tarief

Voorbeeld (TS)

/

0,36

/

TS+0,5pg/μL SOA 1

1：1

0,769

81%

TS+0,5pg/μL SOA 1

1：20

0,777

82%

TS+0,5pg/μL SOA 1

1：250

0.803

82%

Tabel 6. De piekherstelsnelheid analyse

  1. Precisie

  • Precisie binnen de assay

Experimenten werden uitgevoerd op drie concentratieniveaus (hoog, gemiddeld en laag) voor elk van de vier dsRNA-standaardmonsters. Binnen een enkel experiment onderging elk concentratiemonster acht herhaalde tests. De resultaten laten zien dat de variatiecoëfficiënt (CV) onder de 15% ligt wat duidt op een goede intra-assay precisie.

SOA 1

Theoretisch verbinding (pg/μL)

Repliceert

Gemeten gemiddelde (pg/μL)

CV

1

8

1.0002

3,11%

0,125

8

0,1230

0,46%

0,0156

8

0,0164

3,18%

SOA2

Theoretisch verbinding (pg/μL)

Repliceert

Gemeten gemiddelde (pg/μL)

CV

1

8

1.0001

0,65%

0,125

8

0,1231

2,46%

0,0156

8

0,0162

0,02%

SOA3

Theoretisch verbinding (pg/μL)

Repliceert

Gemeten gemiddelde (pg/μL)

CV

2

8

2.0022

1,58%

0,25

8

0,2444

2,17%

0,0312

8

0,0328

1,64%

SOA4

Theoretisch verbinding (pg/μL)

Repliceert

Gemeten gemiddelde (pg/μL)

CV

8

8

8.0803

0,27%

1

8

0,9650

0,12%

0,125

8

0,1322

2.76%

Tabel 7. Intra-assay precisieanalyse

  • Precisie tussen tests

Er werden drie experimenten uitgevoerd met behulp van kits van 3 batches. In elk experiment werden hoge, gemiddelde en lage concentraties gekozen en drie keer getest voor elk van de vier dsRNA-standaardmonsters, met acht replicaties. Bijgevolg werden 24 datapunten verkregen bij elk concentratieniveau, die vervolgens werden gebruikt voor de analyse van de variatiecoëfficiënt (CV). De resultaten laten zien dat de CV voor elke concentratie van de standaarden onder de 15% lag.

SOA 1

Theoretisch verbinding (pg/μL)

Onafhankelijke tests/replicaten

Gemeten gemiddelde (pg/μL)

CV

1

3/8

1.0007

2,38%

0,125

3/8

0,1186

3,20%

0,0156

3/8

0,0173

1,27%

SOA2

Theoretisch verbinding (pg/μL)

Onafhankelijke tests/replicaten

Gemeten gemiddelde (pg/μL)

CV

1

3/8

0,9987

0,09%

0,125

3/8

0,1269

1,06%

0,0156

3/8

0,0151

0,52%

SOA3

Theoretisch verbinding (pg/μL)

Onafhankelijke tests/replicaten

Gemeten gemiddelde (pg/μL)

CV

2

3/8

2.0012

2,37%

0,25

3/8

0,2415

0,14%

0,0312

3/8

0,0330

1,81%

SOA4

Theoretisch verbinding (pg/μL)

Onafhankelijke tests/replicaten

Gemeten gemiddelde (pg/μL)

CV

8

3/8

7.9735

1,89%

1

3/8

1.0225

0,13%

0,125

3/8

0.1227

5,63%

Tabel 8. Inter-assay precisieanalyse

  1. Gevoeligheid

  • LOD

De detectielimiet van de uitrusting wordt bepaald door tweemaal de standaarddeviatie toe te voegen aan het gemiddelde van de blanco waarden. Door de OD van 24 blanco waarden te meten, hun gemiddelde en standaarddeviatie te berekenen en deze waarden vervolgens toe te passen op de aangepaste curve, wordt de bijbehorende detectielimiet wordt verkregen.

OD

dsRNA Standaard

Gemiddelde van blanco

SD van Blanco

Gemiddelde van blanco+2SD

LOD

SOA 1

0,016

0,00048

0,01696

≤0,001 pg/μL

SOA2

0,016

0,00072

0,01744

≤0,001 pg/μL

SOA3

0,034

0,00119

0,03638

≤0,001 pg/μL

SOA4

0,115

0,00290

0,1208

≤0,01 pg/μL

Tabel 9. LOD-analyse

  • LOQ

De kwantitatieve limiet van de uitrusting wordt vastgesteld door het laagste concentratiepunt van de standaardcurve te verdunnen tot nog lagere niveaus, waardoor een CV < 20% bij de laagste concentratie wordt gegarandeerd, waarmee de kwantitatieve drempel wordt gedefinieerd. De LOQ is als volgt.

dsRNA Standaard

LOQ

Repliceert

CV(%)

Herstel (%)

SOA 1

0,0156 pg/μL

24

＜10%

80~120%

SOA2

0,0312 pg/μL

24

＜10%

80~120%

SOA3

0,0156 pg/μL

24

＜10%

80~120%

SOA4

0,125 pg/μL

24

＜10%

80~120%
Tabel 10.LOQ-analyse

  1. Dduurzaamheid

  • Anti-interferentie op IVT-materialen

Deze test gericht op het beoordelen van de impact van verschillende enzymen, buffers, enz., toegevoegd aan de mRNA monster op de dsRNA-detectie door de kit.

Het toevoegen van specifieke concentraties van T7 RNA-polymerase, RNAse-remmer, IPPA (anorganische pyrofosfatase), DNase I, VCE (vaccinia-cappingenzym), 2'-O-methyltransferase (MT), 1×IVT-buffer en 1 mM natriumcitraat aan een verstrekt mRNA-monster en vervolgens gebruik maken van STD3 voor zowel de standaardcurvebereiding als het testen van monsters, waardoor de mogelijkheid van de kit om dsRNA-inhoud in deze te detecteren, kon worden geëvalueerd monsters. De resultaten tonen aan dat de aanwezigheid van acht verschillende enzymen en buffers geen invloed had op de nauwkeurige detectie van dsRNA. Bovendien vielen de waargenomen recovery rates binnen het bereik van 80% tot 120%.

IVT-materialen

dsRNA Gemeten (pg/μL)

Herstel

Geen

0,6057

100%

T7 RNA-polymerase (15 μg/ml)

0,5411

89,32%

Muizen-RNase-remmer (27,5 μg/ml)

0,5142

84,88%

Anorganische pyrofosfatase (IPPA 10μg/ml)

0,7132

117,7%

DNase I (13,75 μg/ml)

0,6077

100,32%

Vaccinia-cappingenzym (10 μg/ml)

0,6563

108,3%

2´-O-methyltransferase (10 μg/ml)

0,5776

95,4%

1×IVT-buffer

0,5003

82,6%

1mM Natriumcitraat

0,6251

103,2%

Tabel 11. Het herstel van verdunde STD3 toegevoegd met IVT-materialen

  • Temperatuur dduurzaamheid

De kits werden opgeslagen bij beide 4°C en 37°C om de concentratievarianties van dsRNA-standaard na 7 dagen te detecteren. De resultaten laten zien dat de varianties allemaal binnen 20% liggen.

dsRNA Standaard

dsRNA Gemeten (pg/μL) Dag 0

De variaties na 7 dagen bij 4°C

SOA 1

1

10%

SOA2

1

5%

SOA3

2

7%

SOA4

4

11%

dsRNA Standaard

dsRNA Gemeten (pg/μL)

De variaties na 7 dagen bij 37°C

SOA 1

1

18%

SOA2

1

4%

SOA3

2

5%

SOA4

4

8%

Tabel 12. Analyse van de temperatuurbestendigheid


      Gerelateerd product:

      Productnaam SKU Specificaties
      Dubbelstrengs RNA (dsRNA) ELISA-kit 36717ES 48T/96T
      CleaScrip™ T7 RNA-polymerase (laag ds RNA, 250 U/μL) 10628ES 10/100 KU
      T7 RNA-polymerase GMP-kwaliteit (250 U/μL) 10625ES 10/100 KU

      Gerelateerd leesvoer:

      De dubbelstrengs RNA (dsRNA) ELISA Kit werd gebruikt om T7 RNA-polymerasemutanten met een laag dsRNA-gehalte te valideren, in combinatie met de J2-antilichaam-dotblottingmethode.

      Laag dsRNA T7 RNA Polymerase Mutanten, Versterken de ontwikkeling van mRNA Vaccins en Therapieën


      Referenties:

      1. ICH, 2022: Analytische methodevalidatie Q2, conceptversie.
      2. NMPA, 2007: Algemene principes voor de evaluatie van analytische methodevalidatie voor biologische productkwaliteitscontroleanalyse
      3. Chinese Farmacopee Commissie (ChPC), 2020: Chinese Farmacopee, Deel Vier: Richtlijnen voor de Validatie van Kwantitatieve Analysemethoden voor Biologische Monsters

      Inquiry