De laatste jaren hebben mRNA-gebaseerde geneesmiddelen veel aandacht gekregen en de aandacht getrokken van wetenschappelijk onderzoek. T7 RNAP staat bekend om zijn eenvoud en het vermogen om RNA-synthese te katalyseren met een hoge opbrengst en trouw in vitro. Tijdens het transcriptieproces kan T7 RNAP echter bijproducten produceren zoals mislukte korte RNA's, voortijdig beëindigde RNA's en 3'-verlengde RNA's, wat gunstige omstandigheden creëert voor de vorming van dsRNA. Daarom is het verminderen van de productie van dsRNA een dringende behoefte geworden in praktische toepassingen.
Onlangs werd een baanbrekend onderzoek gepubliceerd met de titel "FADS en semi-rationeel ontwerp gemodificeerde T7 RNA polymerase verminderde dsRNA productie, met lagere terminale transferase en RDRP activiteiten" werd online gepubliceerd door
FADS-gebaseerde screening van T7 RNAP
Voor het screenen van T7 RNAP werd FADS (Fluorescence-activated droplet sorting) gekozen om te voldoen aan de hoge-doorvoervereisten van proteïne-evolutie. Om voortijdige fragmentatie van cellen te voorkomen, gebruikten onderzoekers een PDMS-chip met dubbele waterige fasen, waarbij lysozyme werd gemengd met de cellen op de chip en zijn activiteit uitoefende in de druppels Figuur 1Onderzoekers hebben verschillende willekeurige mutantenbibliotheken gegenereerd met een diversiteit variërend van 105 tot 106Na screening werden 10 dominante varianten geïdentificeerd en aangeduid als Mut1 tot Mut10. Zoals getoond in Figuur 2E En Figuur 2F, het dsRNA-gehalte van Mut1, Mut7 en Mut9 was aanzienlijk lager dan dat van het wildtype
Figuur 1. Overzicht van de FADS
Figuur 2. Willekeurige bibliotheekscreening en variantenevaluatie
Semi-rationeel ontwerp van T7 RNAP
Onderzoekers voerde een semi-rationeel ontwerponderzoek uit, creëerde tien verzadigde bibliotheken op één locatie en gebruikte de traditionele op microtiterplaten gebaseerde dual probes-methode voor screening(Figuur 3). De toegevoegde 5'-uiteinde-sonde wordt gebruikt voor de detectie van de RNA-opbrengst.
Figuur 3. Structuurgestuurd semi-rationeel ontwerp voor verlaagd dsRNA
Na het screenen van meer dan 1000 mutanten, hebben onderzoekers identificeerde zes kandidaten: Mut11 (K180E), Mut12 (S228F), Mut13 (G238L), Mut14 (A70Q), Mut15 (A383H) en Mut16 (I743L). De totale RNA-opbrengst van alle zes mutanten verschilde niet significant van het wildtype, wat duidt op vergelijkbare algehele transcriptie-efficiëntie. Zoals verwacht was de dsRNA-inhoud van Mut11 en Mut14 significant lager vergeleken met het wildtype(Figuur 4).
Figuur 4. Microtiterplaatscreening en variantevaluatie
Mut17 uit DNA-shuffelen levert minder dsRNA op
Om de T7 RNAP verder te optimaliseren, werden de vier varianten met een laag dsRNA-gehalte en die toch aan de productievereisten voldeden, geselecteerd.Onderzoekers construeerden vervolgens een DNA-shufflingbibliotheek en screenden met microtiterplaten, waarbij ze een variant identificeerden die een lagere dsRNA-productie vertoonde in vergelijking met zijn ouderlijke T7-RNAP, genaamd Mut17 (A70Q/F162S/K180E). Vervolgens analyseerden ze de transcriptionele producten van Mut17 en zijn ouderlijke varianten (Mut14, Mut11 en Mut7). Zoals getoond in Figuur 5, alle vier varianten vertoonden significante reducties in dsRNA-productie tijdens transcriptie vergeleken met het wildtype. Opmerkelijk genoeg vertoonde Mut17 een significant lager dsRNA-gehalte van slechts 1,80% en zo laag als 0,007 ng/μg in het oplosmiddelsysteem van screening.
Figuur 5. dsRNA-inhoud van Mut17 en zijn ouderlijke mutaties
De immunogeniciteit van het IVT-product van de mutant is aanzienlijk lager dan die van het wilde type.
Volgende, We hebben de immunogeniciteit van de IVT-producten bij muizen met RA geëvalueerdW264.7 cellen. Zoals weergegeven in Figuur 2A en 2B, waren de IFN-β mRNA- en eiwitniveaus verlaagd in RAW264.7 cellen die getransfecteerd zijn met mRNA geproduceerd door mutanten vergeleken met wildtype, wat aangeeft dat mRNA gesynthetiseerd door het wildtype T7 RNAP de sterkste immuunrespons opriep, terwijl mRNA van de mutanten een aanzienlijk verminderde respons liet zien. Specifiek was het IFN-β mRNA van cellen behandeld met Mut11 RNA slechts 9,7% van de wild-type behandelde cellen, en zijn eiwit was 12,93 pg/mL. Bovendien vertoonde de expressie van EGFP geen significante verschillen in kwantiteit of kwaliteit tussen mRNA's gegenereerd door verschillende T7 RNAP's (Figuur 6C), die voldoen aan de eisen voor industriële toepassingen.
Figuur 6. IFN-β-respons en EGFP-expressie in zoogdiercellen
De RDRP- en terminale transferase-activiteiten van de mutant zijn veel lager.Wijr dan die van het wilde type.
Om de impact van mutaties op de reductie van dsRNA te onderzoeken, hebben onderzoekers uitgevoerd in silico-onderzoeken naar al deze mutaties. Het resultaat suggereert een duidelijke indicatie van verminderde RDRP-activiteit in de varianten, aangezien ze een verminderde neiging vertonen om RNA als template te gebruiken. Op dezelfde manier kan dit een impact hebben gehad op de terminale transferase-activiteit van T7 RNAP. Zoals getoond in Figuur 7, onder verschillende concentraties vertoonden alle 4 varianten minder dan 50% van de fluorescentiewaarde vergeleken met het wildtype.
Vervolgens werd een 3'-end heterogeniteitstest gebruikt om de terminale transferactiviteit van T7 RNAP te karakteriseren. Wanneer de focus lag op de verhouding RNA met n>0, wat de terminale transferaseactiviteit weerspiegelt, vonden dat deze RNA's 82,94% van het wildtype uitmaakten, terwijl de mutanten de volgende percentages vertoonden: Mut11 (70,29%), Mut7 (67,88%), Mut14 (63,31%) en Mut17 (55,62%) (Figuur 8)Belangrijk is dat deze percentages zeer consistent zijn met de hoeveelheid dsRNA in de producten (Figuur 5)Deze resultaten duiden op een significante reductie in terminale transferase-activiteit van mutanten, wat, samen met de afname in RDRP-activiteit, bijdraagt aan de afname in dsRNA.Specifiek kan de terminale transferase-activiteit een crucialere rol spelen, zoals blijkt uit de laagste accumulatie van n>0 RNA's die is waargenomen in Mut17, dat ook de laagste dsRNA-productie vertoont (Figuur 5 en Figuur 8).
Figuur 7Relatieve RDRP-activiteit
Figuur 8Heterogeniteit in het 3'-uiteinde van RNA-producten
Conclusie
Deze studie levert een robuuste methodologie voor het identificeren van mutanten met een verlaagd dsRNA-gehalte en isoleert succesvol meerdere dsRNA-mutanten met een verlaagde RNA-afhankelijke RNA-polymerase- en terminale transferase-activiteit. Het versterkt de validatie van veiligheid en werkzaamheid die integraal zijn voor mRNA-therapieën aanzienlijk, en onderstreept de diepgaande implicaties ervan voor het bevorderen van mRNA-vaccins en gentherapietoepassingen.
Tegelijkertijd is het moederbedrijf
Bestel Informatie
Hieronder staan representatieve producten die worden aangeboden door