Next Generation Sequencing (NGS) heeft zeer brede klinische en wetenschappelijke onderzoeksmogelijkheden in vakgebieden als ziekteverwekkerdetectie, tumormutatiedetectie en reproductiegenetica. Dit komt door de hoge detectiegevoeligheid, sterke specificiteit en de mogelijkheid om zowel kwalitatieve als kwantitatieve detectie uit te voeren. Het opbouwen van een bibliotheek is een kernstap in NGS en heeft direct invloed op de kwaliteit van de sequentie. Op basis van de richtlijnen voor registratiebeoordeling voor in-vitrodiagnostische (IVD) producten, moeten onderzoeksgegevens van de belangrijkste grondstoffen worden verstrekt. Een uitgebreide analyse en verificatie moet worden uitgevoerd door factoren zoals de basisinformatie, parameterindicatoren en leveringsbronnen van de grondstoffen te combineren om de meest geschikte bron van grondstoffen te bepalen. Het conventionele DNA- en RNA-bibliotheekconstructieproces omvat voornamelijk belangrijke stappen zoals cDNA-synthese, DNA-fragmentatie, adapterligatie en bibliotheekamplificatie, De verschillende stappen bevatten veel soorten ruwe materiaal enzymen. De screening van ruwe materiaal enzymen verlengt de onderzoekscyclus. Op basis hiervan zijn kosteneffectieve en eenvoudige bibliotheekbouwmoduleproducten een nieuwe keuze geworden voor de ontwikkeling van IVD-producten.
Figuur 1. Conventioneel DNA-bibliotheekconstructieproces (links) en RNA-bibliotheekconstructieproces (rechts), waarbij het Illumina-platform als voorbeeld wordt genomen
Omgekeerde transcriptiesynthese is het kernonderdeel van RNA-Seq, Nieuw type van hoog efficiëntie reverse transcriptase, die meerdere functies integreert zoals hoge gevoeligheid, hoge opbrengst van cDNA en de compatibiliteit met sjablonen van complexe structuren is een belangrijk onderzoeksgebied. Het ZymeEditor™-enzymmodificatieplatform van
Figuur 2. Prestaties van 13488ES toegepast in RNA-seq
Vanwege de korte leeslengte van het sequentieplatform moet DNA willekeurig worden gefragmenteerd voordat de bibliotheek kan worden samengesteld. In de beginfase was enzymatische fragmentatie een uitdaging vanwege problemen met uniformiteit en vertekening.
Figuur 3. Fragmentatie-effecten van verschillende DNA-fragmentatie-enzymen: krachtig werkend fragmentatie-enzym (links) en mild werkend fragmentatie-enzym (rechts)
Het conversiepercentage van bibliotheken is een belangrijke indicator voor het evalueren van de kwaliteit van bibliotheken. Een hoog conversiepercentage van bibliotheken betekent in zekere zin een grotere rijkdom van de bibliotheek en een betere uniformiteit van sequentiegegevens. Conventionele T4 DNA-ligase richt zich op het optimaliseren van zeer efficiënte ligatie, maar fragmenten zijn gevoelig voor zelfligatie, wat de conversiesnelheid van de bibliotheek verlaagt en de rijkdom van de bibliotheek en de sequentiekwaliteit beïnvloedt. De
Figuur 4. Thermische stabiliteit en linkerresidu-analyse van 12996ES
PCR-amplificatie-enzymen zijn allemaal vereist bij de voorbereidingsmethoden van de NGS-bibliotheek. De meeste DNA-polymerasen met een hoge betrouwbaarheid hebben een 5'→3'-polymerase-activiteit en een 3'→5'-exonuclease-activiteit. Het kan DNA synthetiseren in de 5'→3' richting terwijl de foutief opgenomen basen worden gecorrigeerd, Zo kan het DNA-fragmenten snel en met grote nauwkeurigheid versterken. Maar er zijn maar weinig enzymen die specifiek zijn ontworpen voor NGS, Er zijn niet veel bibliotheekamplificatieproducten die efficiënt, nauwkeurig en specifiek zijn en die doelen van verschillende groottes en GC-gehaltes kunnen amplificeren zonder vooringenomenheid. Bovendien zijn ze in staat primers vooraf te mengen.
Figuur 5. Stabiliteits- en amplificatiefoutpercentageanalyse van 12980ES
Naast de bovenstaande serie NGS-bibliotheekconstructiemoduleproducten, Wij leveren ook one-stop ruwe enzymproducten, om aan de gecombineerde behoeften van verschillende klanten te voldoen.
| Productcategorie | Productnaam | Cat.Nr. | Opmerking |
| Efficiënte cDNA-synthese | Hifair™ Ultrareverse transcriptase (200 U/μL) | 14604ES | Omgekeerd transcriptie-enzym |
| Hoog NGS™ ds-cDNA-synthesekit | 13488ES | cDNA-synthesemodule | |
| DNA Fragmentatie & Eindreparatie & A-Staart | Hieff™ Smeren | 12907ES | DNA-fragmentase |
| Hieff NGS™ OnePot Pro DNA Fragmentatie Module (eindreparatie en dA-tailing plus) | 12619ES | DNA Fragmentatie & Eind-Reparatie & A-Staartmodule | |
| Reparatie en A-tailing | Hieff NGS® Fast-Pace Eindreparatie/dA-Tailing Module | 12608ES | Eindreparatie- en A-staartmodule |
| Adapterligatie | 10299ES | T4 DNA-ligase | |
| Bibliotheekversterking | 2× Ultima HF-versterkingsmix | 13344ES | Enzym met hoge betrouwbaarheid |