Invoering naar organoïden
Organoïden zijn driedimensionale celculturen waarin stamcellen in een matrixgel zijn ingebed. Onder invloed van chemische kleine-molecuulremmers/activatoren, cytokinen, en middelgrote additieven, Deze culturen ontwikkelen zich tot orgaanachtige weefselstructuren.
Karakterisering van organoïden
Organoïden hebben de vaardigheid naar zelf vernieuwen, behouden de fysiologisch structuur En functie van het bronweefsel, en staan bekend als "micro-organen in een petrischaal". Met behulp van de zelfvernieuwende, differentiatie- en zelf-organiserende vermogens van stamcellen, organoïden kunnen cryoconserveerd worden voor gebruik als biobanken En uitgebreid voor onbepaalde tijd. Organoïden vertonen een hoge complexiteit en lijken meer op de in vivo toestand dan traditionele 2D-celculturen.
![Figure 1. Organoid culture of human colon adenocarcinoma cells [1]](https://cdn.shopify.com/s/files/1/0803/9419/1166/files/1_5935b867-79e5-4a23-859d-b65fcd8e4c44_1024x1024.png?v=1740728801)
Figuur 1. Organoïde cultuur van menselijk dubbele punt adenocarcinoom cellen [1]
Sollicitatie van organoïden
Organoïden maken een superieure simulatie van de in vivo-omgeving mogelijk, het overbruggen van de kloof tussen diermodellen en cellulaire studies. Ze dienen als krachtige hulpmiddelen voor tumoronderzoek, drugsonderzoek, regeneratieve geneeskunde, en andere velden, met toepassingen variërend van functionele weefselinductie tot klinische translationele studies. en zijn op grote schaal gebruikt in een verscheidenheid aan aspecten van onderzoek, zoals functionele weefselinductie, ziektemodellering, drugsonderzoek, ontstekingsremmende testen, klinische eindstudies en ander onderzoek, en zijn gebruikt in fundamenteel onderzoek en translationele toepassingen.De vooruitzichten voor toepassing zijn uitstekend in fundamenteel onderzoek en translationele toepassingen.
Met de voortdurende ontwikkeling van Organoïde cultuursystemen en experimentele technieken, organoïde culturen zijn gebruikt voor een verscheidenheid aan weefsels en organen, waaronder darmen (dunne darm/dikke darm), maag, lever, hart, longen, prostaat, alvleesklier, nieren, borstklieren, brein, netvlies, en het binnenoor.
Organoïden afkomstig van tumorstamcellen lijken ook een groot potentieel te hebben om het mechanisme van tumorontwikkeling te helpen begrijpen., screening van medicijngevoeligheid, en het promoten van precisiegeneeskunde en gepersonaliseerde diagnose. Verschillende papers van Cell and Science hebben aangetoond dat tumororganoïden een hoge gevoeligheid en specificiteit hebben bij het voorspellen van de effectiviteit van antikankermedicijnen. Onlangs, Uit onderzoek is gebleken dat tumororganoïden nuttig zijn bij het voorspellen van de reactie van patiënten op kankermedicijnen en bij het ontwikkelen van gepersonaliseerde medicijnregimes.
1.Onderzoek naar ontwikkelingsmechanismen: Het differentiatievermogen van organoïden kan worden gebruikt bij het bestuderen van embryonale ontwikkelingsprocessen en hun mechanismen.
Organoïden reguleren processen die worden geïnduceerd door signaalpaden zoals Wnt en BMP, die gebruikt kan worden om de ontwikkeling van organen zoals de hersenen te bestuderen, alvleesklier en maag.[2][3][4]
2.Modellering van ziekteschade: organoïde-geïnduceerde specifieke weefsels of organen die gebruikt kunnen worden voor onderzoek naar specifieke ziektemodellen.
Het team van Bing Zhao en Xinhua Lin paste een mensachtig orgaaninfectiemodel toe om het moleculaire mechanisme van SARS-CoV-2 (het nieuwe coronavirus) infectie en schade aan de lever te bestuderen, wat een belangrijk hulpmiddel is voor het onderzoek naar de pathogenese van het neocoronavirus en de daaropvolgende ontwikkeling van medicijnen.[5]
De onderzoeksgroep van Deng Hongkui aan de School of Biological Sciences van de Universiteit van Peking heeft een nieuwe organoïde van de dunne darm geconstrueerd - Hyperorganoïde met kenmerken van regeneratie van verwondingen in vitro door kleine moleculen en cytokines te gebruiken voor stimulatie. Deze organoïde heeft de kenmerken om het genoom te kunnen versterken en behouden bij langdurige transmigratie, bevorderen het herstel van schade aan het colonweefsel, en pathologische symptomen verlichten in diermodellen van acute colitis.[6]
3.Regeneratieve geneeskunde: stamcel-afgeleide organoïden, die in staat zijn om beschadigd of ziek weefsel te repareren of te vervangen om de normale weefselfunctie te herstellen, hebben een breed scala aan toepassingen in celtherapie, ook voor andere neurodegeneratieve ziekten, suikerziekte, hart- en vaatziekten, retinopathie en letsels aan de wervelkolom.
Als een nieuwe therapeutische modaliteit op het gebied van regeneratieve geneeskunde maakt DA01 gebruik van de kleine moleculen SB-431542 (Cat.nr. 53004ES), LDN193189 (Cat.nr. 53012ES), CHIR-99021
(Cat.nr. 53003ES), en Y-27632 (Cat#53006ES, Cat.nr. 52604ES), en Sonic Hedgehog (Shh)-eiwit (Cat#92566ES, Cat.nr. 92589ES), om de differentiatie van pluripotente stamcellen in dopaminerge neuronen te stimuleren en transplantatie in de beschadigde hersengebieden van patiënten met gevorderde ziekte van Parkinson, om nieuwe richtingen en ideeën te bieden voor de behandeling van de ziekte.[7]
4.Testen op toxiciteit en werkzaamheid van geneesmiddelen: gebruik van organoïden om de farmacokinetische toxiciteit van nieuwe geneesmiddelen in specifieke organen of weefsels te verifiëren, het leveren van dataondersteuning voor de ontwikkeling van nieuwe medicijnen.
De nefrotoxiciteit van Cisplatine (cisplatine) werd geverifieerd met behulp van de Hyman-nierorganoïde.[8]
5.Drugsscreening: Stamcel-afgeleide organoïden kunnen worden gebruikt voor in vitro-testen van medicijnreacties, het bieden van theoretische ondersteuning voor drugsscreening
Colonorganen kunnen worden gebruikt om doseringsschema's bij patiënten met CFTR-mutaties te bestuderen, en tumororganen kunnen worden gebruikt om de individuele dosering bij patiënten te bepalen.[9]
De evolutie van organoïden
Bronnen van organoïden
Normale organoïden zijn voornamelijk afkomstig van stamcellen, waaronder pluripotente stamcellen (PSC's) en volwassen stamcellen (ASC's), waarvan pluripotente stamcellen embryonale stamcellen (ESC's) omvatten, geïnduceerde pluripotente stamcellen ( Geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC's). Vergeleken met pluripotente stamcellen, volwassen stamcellen hebben het voordeel van een gemakkelijke en snelle modellering, maar het nadeel is dat de geconstrueerde organoïde structuren relatief eenvoudig zijn. De organoïde structuren geconstrueerd door pluripotente stamcellen zijn complexer.
Organoïde cultuur
| OrganoiD Type | Vereist Swinkelcentrum Moliebol | Vereist Grij Facteurs | Media En Additieven |
| Dunne darm | J-27632, SB-202190, A 83-01, Gastrine, Nicotineamide | EGF, Noggin, R-Spondin 1, Wnt-3a | HEPE'S, L-alanyl-L-glutamine-oplossing, penicilline-streptomycin, N-2 |
| Gastrisch | J-27632, SB-202190, A 83-01, Gastrine I, Nicotineamide | FGF-10, EGF, Noggin, R-Spondin 1, Wnt-3a | HEPE'S, L-alanyl-L-glutamine-oplossing, penicilline- streptomycin |
| Ikleverziekte | J-27632, A 83-01, DAPT, Forskoline, Gastrine, Nicotineamide, Prostaglandine E2 | BMP-4, EGF, FGF-basis, FGF-10, HGF, Noggin, Wnt-3a | N-2, HEPE'S, L-alanyl-L-glutamine-oplossing, penicilline-streptomycine |
| nier | CHIR-99021、Retinoïnezuur | BMP-2、BMP-4、BMP-7、FGF-basis 、FGF-9 | HEPE'S, L-alanyl-L-glutamine-oplossing, penicilline-streptomycine |
| Ikjong | CHIR-99021、SB-431542 | Activine A、FGF-basis、FGF-4、Noggin | HEPE, L-alanyl-L-glutamine-oplossing, penicilline-streptomycine |
| Paars | Gastrine ik、Een 83-01、Nicotineamide | FGF-10、 EGF、Noggin、R-Spondin 1、Wnt-3a | HEPE, L-alanyl-L-glutamine-oplossing, penicilline-streptomycine |
| Proteren | J-27632、SB-202190、Een 83-01、Nicotineamide、Prostaglandine E2、Testosteron | EGF、Activine A、FGF-basis、FGF-10、Noggin、R-Spontaan in 1、Wnt-10b | HEPE'S, L-alanyl-L-glutamine-oplossing, penicilline-streptomycine |
| Mammary klier | J-27632 | Hier gulin β-1、R-Spondin 1、R-Spondin 2、Noggin、EGF、 FGF-basis、FGF-10、Wnt-3a、Prolactine | HEPE'S, L-alanyl-L-glutamine-oplossing, penicilline-streptomycine |
| Retina | CHIR-99021、J-27632 | ZHH、Wnt-3a | HEPE'S, L-alanyl-L-glutamine-oplossing, penicilline-streptomycine |
| Ibinnenoor | SB-431542、Een 83-01 | BMP-4、 FGF-basis | HEPE'S, L-alanyl-L-glutamine-oplossing, penicilline-streptomycine |
| Bregen | J-27632、MK-2206、GDC-0068、Dorsomorfine | FGF-basis、Noggin、DKK-1、 EGF、BDNF、GDNF | B-27, HEPE'S, L-alanyl-L-glutamine-oplossing, penicilline-streptomycine |
Ssamenvatting van sMalle moleculen die vaak worden gebruikt in organoïde culturen: super bruikbaar, Vergeet niet om het te bookmarken!
❶ Y-27632 (Cat.nr. 53006ES), Cat#52604ES): Het is een krachtige remmer van gesteente, die p160ROCK (Ki=140 nM) en ROCK-II (IC50=800 nM) competitief met ATP remt, en remt ook PRK2 (IC50= 600 nM), en het wordt meestal toegevoegd bij de eerste kweek in de zaadplaat, maar niet in de daaropvolgende cultuur.Y-27632 (10 µM) kan de apoptose van stamcellen remmen, Verbeter de kloneringsefficiëntie en verleng de celgeneratie door menselijke embryonale stamcellen 1 uur lang te behandelen met Y-27632 (10 µM).
De aanbevolen werkconcentratie is 10 μM
❷ SB-202190 (Cat#53005ES): Een krachtige p38 MAPK-kinaseremmer gericht op p38α/β. SB202190 induceert de differentiatie van menselijke embryonale stamcellen tot cardiomyocyten, bevordert de zelfvernieuwing van neurale stamcellen, en kan worden gebruikt in gastro-intestinale en mammaire organoïdeculturen.
Aanbevolen oplossingsconcentratie: 10 mg opgelost tot 10 mM door toevoeging van 3,018 ml DMSO-oplossing en in porties bewaard bij -20°C.
De aanbevolen werkconcentratie is 10 μM
❸ CHIR-99021 (Cat# 53003ES): Een aminopyrimidinederivaat dat werkt als een remmer van GSK-3 (GSK3α/β), die de differentiatie van menselijke embryonale stamcellen naar het endoderm induceert, en wordt gebruikt in nier- en netvliesorganoïdeculturen. CHIR-99021, in combinatie met andere reagentia, stimuleert de herprogrammering van somatische cellen tot stamcellen.
Aanbevolen oplossingsconcentratie: 5 mg opgelost tot 3 mM door toevoeging van 3,58 ml DMSO-oplossing en in porties bewaard bij -20°C.
De raanbevolen werkconcentratie: 3 μM
❹ A 83-01 (Cat#53002ES): is een Activin/NODAL/TGF-β pathway inhibitor die de ALK5/4/7 kinase activiteit remt en over het algemeen wordt gebruikt in lever, prostaat, en mammaire organoïde culturen, en wordt vaak gebruikt om de differentiatie van iPSC's te remmen en om de zelfvernieuwing van cellen in vitro te behouden. Aanbevolen oplossingsconcentratie: 5 mg toegevoegd aan 5,93 ml DMSO-oplossing om op te lossen tot 2 mM, -20 ℃ verdeeld en opgeslagen. (Speciale opmerking: Dit product is instabiel in opgeloste toestand, (Het is aan te raden om het nu te gebruiken.)
De raanbevolen werkconcentratie: 2 μM
❺ Gastrine I (Cat#53007ES): Gastrine is een endogeen gastro-intestinaal peptidehormoon dat de afscheiding van maagzuur uit maagwandcellen stimuleert. Gastrine bindt aan de cholecystokinine B-receptor (CCKBR), wat de intracellulaire Ca2+ verhoogt, bevordert de productie van fosfatidylinositol, en proteïnekinase C-activering. Gastrine is ook betrokken bij de proliferatie en differentiatie van maag-epitheelcellen en wordt gebruikt bij de studie van gastro-intestinale organen. De toevoeging van gastrine is vereist om de overleving van darm- en leverorganoïden in kweek te verlengen.
Aanbevolen oplossingsconcentratie: 1 mg opgelost tot 0,2 mM door toevoeging van 2,38 ml 1% ammoniakoplossing en in porties bewaard bij -20°C.
De raanbevolen werkconcentratie: 10 nM
❻ Nicotinamide Nicotinamide (Cat.nr. 51402ES): Een B3-vitamine die betrokken is bij verschillende enzymatische redoxreacties en wordt gebruikt bij gastro-intestinale, lever, en mammaire organoïdeculturen.
Nicotinamide wordt in combinatie met cytokines en andere biochemicaliën gebruikt om ontstekingsremmende eigenschappen uit te oefenen en de differentiatie van MSC's in insulineproducerende cellen te bevorderen, om de activiteit van sirtuinen te remmen, en om de vorming van organoïden te bevorderen en de levensduur ervan te verlengen.
Aanbevolen oplossingsconcentratie: 100 mg opgelost in 100 mM door toevoeging van 8,19 ml H2O (of DMSO) en in porties bewaard bij -20°C.
De raanbevolen werkconcentratie: 10 mM
❼ Forskoline trichotheceen (Cat#51001ES): Activeert adenylylcyclase en wordt vaak gebruikt om de intracellulaire cAMP-niveaus te verhogen. Forskoline induceert de differentiatie van veel celtypen en activeert PXR en FXR. Het heeft bloedplaatjes-anticoagulerende en antihypertensieve effecten en, wanneer gecombineerd met andere kleine moleculen, kan fibroblast-herprogrammering tot iPSC's induceren. Deze stof moet worden toegevoegd aan leverorganoïdeculturen. geherprogrammeerd in iPSC's. moet worden toegevoegd tijdens leverachtige orgaancultuur. Aanbevolen werkconcentratie: 1-10 μM
❽ Prostaglandine E2 (Cat#60810ES): Prostaglandine E2 (PGE2) reguleert veel fysiologische systemen, bemiddelt celproliferatie en -differentiatie bij binding aan specifieke receptoren, moet worden toegevoegd aan lever- en prostaat-achtige orgaanculturen, en is betrokken bij het sparen van gladde spieren, ontsteking, vruchtbaarheid, regulatie van de slaapcyclus en integriteit van het maagslijmvlies.
Aanbevolen oplossingsconcentratie: 1 mg toegevoegd aan 0,28 ml DMSO-oplossing opgelost tot 10 mM en in porties bewaard bij -20°C.
Aanbevolen werkconcentratie: 500 nM
❾ N-acetyl-L-cysteïne (Cat#50303ES): N-acetyl-L-cysteïne (NAC) is een voorloper van de antioxidant glutathion, die antioxiderende eigenschappen heeft, en een ROS-remmer die apoptose in neuronale cellen remt, en die aan de meeste organoïdeculturen moet worden toegevoegd.
Aanbevolen oplossingsconcentratie: 2 g toegevoegd aan 24,51 ml H2O (of DMSO), opgelost tot 500 mM en in porties bewaard bij -20°C.
Aanbevolen werkconcentratie: 1 mM
Product AanbevelingN
Kleine moleculaire verbindingen (remmers/activatoren)
| Productnaam | Catalogusnummer | Sverfijning |
| Retinoïnezuur zuur (retinoïnezuur zuur, retinoïnezuur zuur) | 100 mg/500 mg/1 G | |
| A 83-01 | 1 mg/5 mg/10 mg | |
| CHIR-99021 | 2 mg/5 mg/10 mg | |
| SB-431542 | 5 mg/10 mg/50 mg | |
| SB-202190 | 5 mg/10 mg/25 mg | |
| J-27632 | 1 mg/5 mg/10 mg | |
| Gastrine I (menselijk) | 1 mg/5 mg | |
| MK-2206 2HCl | 1 mg/5 mg/10 mg | |
| GDC-0068 (Ipatasertib; RG7440; (GDC0068) | 53009ES | 1 mg/5 mg/10 mg |
| (Dorsomorfine (2HCl) | 53010ES | 1 mg/5 mg/10 mg |
| J-27632 dihydrochloride | 5 mg/10 mg/25 mg | |
| Nicotineamide | 1 g/5 G | |
| DAPT (GSI-IX, LY-374973) | 5 mg/25 mg | |
| Forskoline Haar Keel | 10 mg/50 mg/100 mg/1 G | |
| Prostaglandine (PG) E2 Prostaglandine E2 | 60810ES | 1 mg |
| Testosteron | 60803ES | 1 g/5 G |
| NAC (N-acetyl-L-cysteïne) | 50303ES | 2 G |
| RepSox | 5 mg/10 mg/25 mg | |
| LDN193189 (DM-3189) | 53012ES | 5 mg/10 mg |
Media en supplementen
| Catalogusnummer | Sverfijning | |
| HEPE'S Vrij Zuur Cel Cultuur Cijfer | 60110ES | 100 g/500 G |
| L-alanyl-L-glutamine oplossing, 200 mmm L-alanyl-Ik-glutamine, 200 mmm | 60701ES | 20 ml/100 ml/500 ml |
| Penicilline-streptomycine (100×), Geschikt voor Cel Ik kunst Penicilline-streptomycine (Dubbele Antilichaam) voor C el Cultuur |
100 ml | |
| B-27 serumvrij medium, 50 X | 60703ES | 10 ml |
| N-2 supplement, serum vrij, 100X N-2 serum vrij additief, 100× | 60706ES | 5 ml |
Cytokinen
| Productnaam | Catalogusnummer | Sverfijning |
| Recombinant Menselijk Activine A | 10 μg/100 μg/500 μg | |
| 10 μg/100 μg/500 μg | ||
| Recombinant Menselijk DKK-1 | 20 μg/100 μg/500 μg | |
| Recombinant Menselijk EGF | 100 μg/500 μg | |
| Recombinant Menselijk bFGF | 10 μg/100 μg/500 μg | |
| Recombinant Menselijk FGF-4 | 5 μg/100 μg/500 μg | |
| Recombinant Menselijk FGF-9 | 91305ES | 5 μg/100 μg/500 μg |
| Recombinant Menselijk FGF-10 | 91306ES | 5 μg/100 μg/500 μg |
| Recombinant Menselijk GDNF | 10 μg/100 μg/500 μg | |
| Recombinant Menselijk Noggin | 5 μg/100 μg/500 μg | |
| Recombinant Menselijk NRG1-bèta1 | 10 μg/100 μg/500 μg | |
| Recombinant Menselijk R-Spondine 1 | 92274ES | 100 μg/1 mg |
| Recombinant Menselijk Ssst | 5 μg/100 μg/500 μg | |
| Recombinant Menselijk BAFF | 5 μg/100 μg/500 μg | |
| Recombinant Menselijk sCD40 Ligand | 10 μg/100 μg/500 μg | |
| Recombinant Menselijk BMP-4 | 10 μg/100 μg/500 μg | |
| Recombinant Menselijk HGF | 5 μg/100 μg/500 μg | |
| Recombinant Menselijk BDNF | 5 μg/20 μg/100 μg |
Miniklas: Kleine moleculaire verbindingen zijn verbindingen met een molecuulgewicht van minder dan 1000 Da (vooral minder dan 500 Da) en die biologische activiteit hebben.In tegenstelling tot cytokines en eiwitten, kleine moleculen kunnen de cel binnendringen via het celmembraan en hun biologische functies vervullen. Kleine molecuulverbindingen hebben een breed scala aan doelen en zijn op grote schaal gebruikt in veel belangrijk onderzoek vakgebieden in de levenswetenschappen, zoals stengel cellen, organoïden, immunologie, neurobiologie, epigenetica, apoptose, ionkanalen, oncologie en signaaltransductie.
Referenties
[1] Sato T, Stange DE, et al. Langetermijnexpansie van epitheliale organoïden uit menselijk colon, adenoom, adenocarcinoom en Barrett-epitheel. Gastroenterology. 2011 nov;141(5):1762-72. doi:10.1053/j.gastro.2011.07.050. Epub 2011 sep 2. PMID: 21889923.
[2] Lancaster MA, Renner M, et al. Cerebrale organoïden modelleren de ontwikkeling van de menselijke hersenen en microcefalie. Nature. 2013;501(7467):373-379. doi:10.1038/nature12517.
[3] Greggio C, et al. Kunstmatige driedimensionale niches deconstrueren de ontwikkeling van de pancreas in vitro. Ontwikkeling. 2013.140(21):4452-4462. http://dx.doi.org/10.1242/dev.096628.
[4] McCracken KW, et al. Modellering van menselijke ontwikkeling en ziekte in van pluripotente stamcellen afgeleide maagorganoïden. nature. 2014.516(7531):400- 404. http://dx.doi.org/10.1038/nature13863.
[5] Zhao B, Ni C, et al. Recapitulatie van SARS-CoV-2-infectie en cholangiocytenschade met humane leverkanaalorganoïden. Protein Cell. 2020 okt;11(10 ):771-775. doi: 10.1007/s13238-020-00718-6. PMID: 32303993; PMCID: PMC7164704.
[6] Qu M, Xiong L, et al. Oprichting van intestinale organoïdeculturen die letsel-geassocieerde epitheliale regeneratie modelleren. Cell Res. 2021 mrt;31(3). 259-271. doi: 10.1038/s41422-020-00453-x. Epub 2021 8 jan. PMID:
[7] PMC-ID: PMC8027647.
[8] BlueRock Therapeutics kondigt eerste patiënt aan die is gedoseerd met DA01 in fase 1-studie bij patiënten met gevorderde ziekte van Parkinson. BlueRock Therapeutics persbericht: 8 juni 2021.
[9] Takasato M, Er PX, et al.Nierorganoïden van menselijke iPS-cellen bevatten meerdere afstammingslijnen en modelleren de menselijke nefrogenese. nature. 2015.526(7574):564 -568. http://dx.doi.org/10.1038/nature15695.
[10] Spence JR, Mayhew CN, et al. Gerichte differentiatie van humane pluripotente stamcellen in darmweefsel in vitro. Nature. 2011.470(7332):105- 109. http://dx.doi.org/10.1038/nature09691.
