Uitgebreide gids voor organoïde teelt

— Een uitgebreid artikel om uw begrip van organoïden te verdiepen.

Inleiding tot organoïden

Organoïden zijn driedimensionale structuren met fysiologische functies die de normale (of zieke) toestand van interne organen of weefsels nabootsen, bereikt door 3D-kweek buiten het lichaam. Simpel gezegd zijn organoïden driedimensionale celculturen waarin stamcellen worden gekweekt in een matrixgel. Onder invloed van chemische remmers/activatoren, cytokines en cultuuradditieven ontwikkelen organoïden zich tot weefselstructuren die lijken op overeenkomstige organen.

Kenmerken van organoïden

Organoïden bezitten zelfvernieuwende capaciteiten, waarbij de fysiologische structuur en functie van het bronweefsel behouden blijven. Ze worden vaak aangeduid als "micro-organen in een schaaltje." Door gebruik te maken van de zelfvernieuwende, differentiatie- en zelf-organiserende capaciteiten van stamcellen, kunnen organoïden worden gecryopreserveerd voor gebruik in biobanken en kunnen ze onbeperkt worden uitgebreid. Organoïden zijn zeer complex en lijken, vergeleken met 2D-cellen, meer op de in vivo-toestand.

Figuur 1. Organoïde kweek van menselijke colonadenocarcinoomcellen [1]

Toepassingen van organoïden

Het onderscheidende kenmerk van organoïden is hun vermogen om de in vivo-omgeving beter te simuleren, waardoor ze geschikt zijn voor moleculaire en cellulaire biologische analyses. Organoïden overbruggen de kloof tussen dierlijk en cellulair niveau en bieden een superieure oplossing voor onderzoek op gebieden zoals tumorstudies, geneesmiddelenonderzoek, regeneratieve geneeskunde en meer. Ze zijn op grote schaal toegepast in functionele weefselinductie, het opzetten van ziektemodellen, geneesmiddelenonderzoek, ontstekingsremmende testen, klinisch onderzoek en verschillende andere onderzoeksaspecten, en tonen een groot potentieel in zowel fundamenteel onderzoek als translationele toepassingen.

Naarmate de kweeksystemen en experimentele technieken voor organoïden zich verder ontwikkelen, worden organoïden gebruikt voor verschillende weefsels en organen, waaronder de darmen (dunne darm/dikke darm), maag, lever, hart, longen, prostaat, alvleesklier, nieren, borsten, hersenachtige structuren, netvlies, binnenoor en meer.

Organoïden afkomstig van tumorstamcellen hebben een significant potentieel getoond in het begrijpen van de mechanismen van tumoren en -ontwikkeling, het screenen van medicijngevoeligheid en het bevorderen van precisiegeneeskunde en gepersonaliseerde diagnose. Meerdere artikelen van Cell and Science geven aan dat organoïden een hoge gevoeligheid en specificiteit vertonen bij het voorspellen van de effectiviteit van antikankermedicijnen. Onlangs hebben tumororganoïden hun rol aangetoond bij het voorspellen van patiëntreacties op kankermedicijnen en bij het helpen formuleren van gepersonaliseerde behandelplannen.

Onderzoek naar ontwikkelingsmechanismen: De differentiatiecapaciteiten van organoïden maken ze geschikt voor het bestuderen van embryonale ontwikkelingsprocessen en -mechanismen. De inductieprocessen die worden gereguleerd door signaalpaden zoals Wnt en BMP kunnen worden gebruikt om de ontwikkeling van organen zoals de hersenen, pancreas en maag te bestuderen [2][3][4].

Het vaststellen van ziekte-letselmodellen: Organoïden die zijn geïnduceerd door specifieke weefsels of organen kunnen worden gebruikt om modellen van specifieke ziekten te bestuderen. Teams onder leiding van Zhao Bing en Lin Xinhua gebruikten menselijke organoïde-infectiemodellen om de moleculaire mechanismen van SARS-CoV-2-infectie en leverschade te bestuderen, wat cruciale hulpmiddelen bood voor het onderzoeken van de pathogene mechanismen van het virus en de daaropvolgende ontwikkeling van medicijnen [5]. De onderzoeksgroep onder leiding van Deng Hongkui aan de School of Life Sciences van de Universiteit van Peking gebruikte kleine moleculen en cytokinen om de constructie van een nieuwe intestinale organoïde met kenmerken van schaderegeneratie te stimuleren: Hyper Organoid.Deze organoïde kan gedurende een langere periode worden doorgegeven en versterkt, waardoor het genoom behouden blijft en het herstel van de schade aan het colonweefsel wordt bevorderd, de pathologische symptomen in een diermodel voor acute colitis worden verlicht, en meer [6].

Regeneratieve geneeskunde: stamcel-afgeleide organoïden kunnen beschadigd of ziek weefsel repareren of vervangen om de normale weefselfunctie te herstellen. Ze hebben uitgebreide toepassingen in celtherapie, waaronder voor andere neurodegeneratieve ziekten, diabetes, hart- en vaatziekten, netvliesaandoeningen, verwondingen aan het ruggenmerg en meer. Als een nieuwe behandeling op het gebied van regeneratieve geneeskunde stimuleert DA01, met behulp van kleine moleculen zoals SB-431542, LDN193189, CHIR-99021, Y-27632 en Sonic Hedgehog (Shh)-eiwit, pluripotente stamcellen om te differentiëren tot dopaminerge neuronen. Deze neuronen worden vervolgens getransplanteerd naar de beschadigde gebieden van de hersenen van patiënten met de ziekte van Parkinson in een laat stadium, wat een nieuwe richting en benadering biedt voor de behandeling van de ziekte [7].

Toxiciteit en werkzaamheidstesten van geneesmiddelen: Organoïden kunnen worden gebruikt om de farmacotoxiciteit van nieuwe geneesmiddelen in specifieke organen of weefsels te verifiëren, en bieden zo dataondersteuning voor de ontwikkeling van nieuwe geneesmiddelen. Het gebruik van Hyman-nierorganoïden om de niertoxiciteit van Cisplatine te verifiëren is een voorbeeld [8].

Geneesmiddelenscreening: Organoïden afkomstig van stamcellen kunnen worden gebruikt voor in vitro-testen van geneesmiddelreacties, wat theoretische ondersteuning biedt voor geneesmiddelenscreening. Colonorganoïden kunnen worden gebruikt om medicatieplannen voor patiënten met CFTR-mutaties te bestuderen, en tumororganoïden kunnen worden gebruikt om geïndividualiseerde medicatiesituaties voor patiënten te beoordelen [9].

Ontwikkelingsgeschiedenis van organoïden

Bronnen van organoïden

Normale organoïden zijn voornamelijk afkomstig van stamcellen, waaronder pluripotente stamcellen (PSC's) en volwassen stamcellen (ASC's). Pluripotente stamcellen omvatten embryonale stamcellen (ESC's) en geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC's). Vergeleken met pluripotente stamcellen hebben volwassen stamcellen het voordeel dat ze eenvoudiger en sneller te modelleren zijn, maar het nadeel dat ze relatief eenvoudiger organoïde structuren construeren. Organoïde structuren die zijn geconstrueerd uit pluripotente stamcellen zijn complexer.

Producten gebruikt in Organoïden teelt

Veelgebruikte kleine moleculen in organoïdeculturen (samenvatting): Superhandig, vergeet niet om te bookmarken!

❶ Y-27632 (Cat#53006ES, Cat#52604ES): Een krachtige remmer van Rock, die p160ROCK (Ki=140 nM) en ROCK-II (IC50=800 nM) competitief remt door ATP-competitie.Het remt ook PRK2 (IC50=600 nM). Wordt doorgaans toegevoegd tijdens de eerste zaaiing in plaatcultuur; daaropvolgende mediumveranderingen vereisen mogelijk geen toevoeging. Behandeling van menselijke embryonale stamcellen met Y-27632 (10 µM) gedurende 1 uur kan apoptose remmen, de efficiëntie van de kloon verhogen en celpassages verlengen.

Aanbevolen werkconcentratie: 10 μM

❷ SB-202190 (Cat#53005ES): Een efficiënte p38 MAPK-kinaseremmer, gericht op p38α/β. SB202190 kan differentiatie van menselijke embryonale stamcellen tot hartspiercellen induceren, de zelfvernieuwing van neurale stamcellen bevorderen en is toepasbaar op de kweek van gastro-intestinale en borstklierorganoïden.

Aanbevolen oplossingsconcentratie: Los 10 mg op in 3,018 ml DMSO om een ​​10 mM oplossing te verkrijgen; bewaar bij -20℃.

Aanbevolen werkconcentratie: 10 μM

❸ CHIR-99021 (Cat#53003ES): Een aminopyrimidinederivaat, dat werkt als een GSK-3 (GSK3α/β)-remmer. Het induceert differentiatie van menselijke embryonale stamcellen in het endoderm en wordt gebruikt in nier- en retinale organoïdeculturen. CHIR-99021 stimuleert, wanneer het in combinatie met andere reagentia wordt gebruikt, de herprogrammering van somatische cellen in stamcellen.

Aanbevolen oplossingsconcentratie: los 5 mg op in 3,58 ml DMSO om een ​​3 mM oplossing te verkrijgen; bewaar bij -20℃.

Aanbevolen werkconcentratie: 3 μM

❹ A 83-01 (Cat#53002ES): Een Activin/NODAL/TGF-β pathway inhibitor, die ALK5/4/7 kinase activiteit remt. Wordt over het algemeen gebruikt in de kweek van lever-, prostaat- en borstklierorganoïden. Het wordt vaak gebruikt om de differentiatie van geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs) te remmen en de zelfvernieuwing van cellen in vitro te behouden.

Aanbevolen oplossingsconcentratie: Los 5 mg op in 5,93 ml DMSO om een ​​2 mM oplossing te verkrijgen; bewaar bij -20℃. (Let op: Dit product is instabiel in oplossing en wordt aanbevolen voor onmiddellijk gebruik na bereiding.)

Aanbevolen werkconcentratie: 2 μM

❺ Gastrine I (Cat#53007ES): Gastrine is een endogeen gastro-intestinaal peptidehormoon dat maagwandcellen stimuleert om maagzuur af te scheiden. Het is cruciaal voor studies naar gastro-intestinale organoïden. Bij het kweken van intestinale en hepatische organoïden helpt het toevoegen van gastrine de overlevingstijd van organoïden te verlengen.

Aanbevolen oplossingsconcentratie: Los 1 mg op in 2,38 ml van een 1% ammoniakoplossing om een ​​0,2 mM oplossing te verkrijgen; bewaar bij -20℃.

Aanbevolen werkconcentratie: 10 nM

❻ Nicotinamide (Cat#51402ES): Nicotinamide, een B3-vitamine, neemt deel aan verschillende enzymatische redoxreacties en wordt gebruikt in de kweek van gastro-intestinale, hepatische en borstklierorganoïden. Nicotinamide vertoont, in combinatie met cytokines en andere biochemische reagentia, ontstekingsremmende eigenschappen, bevordert de differentiatie van mesenchymale stamcellen in insulineproducerende cellen, remt de activiteit van sirtuinen en wordt gebruikt om organoïdevorming te bevorderen en de levensduur van organoïden te verlengen.

Aanbevolen oplossingsconcentratie: Los 100 mg op in 8,19 ml H2O (of DMSO) om een ​​100 mM oplossing te verkrijgen; bewaar bij -20℃.

Aanbevolen werkconcentratie: 10 mM

❼ Forskoline (Cat#51001ES): Forskoline kan adenylaatcyclase activeren, dat vaak wordt gebruikt om intracellulaire cAMP-niveaus te verhogen. Forskoline induceert differentiatie van verschillende celtypen, activeert PXR en FXR en heeft antiplaatjesaggregatie en antihypertensieve effecten. Bij het kweken van leverorganoïden is het essentieel om deze stof toe te voegen.

Aanbevolen werkconcentratie: 1-10 μM

❽ Prostaglandine E2 (Cat#60810ES): Prostaglandine E2 (PGE2) reguleert veel fysiologische systemen en bemiddelt bij celproliferatie en -differentiatie.Het is nodig bij het kweken van lever- en prostaatorganoïden en wordt in verband gebracht met ontspanning van de gladde spieren, ontstekingen, voortplanting, regulering van de slaapcyclus en de integriteit van het maagslijmvlies.

Aanbevolen oplossingsconcentratie: Los 1 mg op in 0,28 ml DMSO om een ​​10 mM oplossing te verkrijgen; bewaar bij -20℃.

Aanbevolen werkconcentratie: 500 nM

❾ N-acetyl-L-cysteïne (Cat#50303ES): N-acetyl-L-cysteïne (NAC) is een voorloper van de antioxidant glutathion, met antioxiderende en ROS-remmende effecten. Het remt neuronale celapoptose en is vereist in het kweekproces van de meeste organoïden.

Aanbevolen oplossingsconcentratie: Los 2 g op in 24,51 ml H2O (of DMSO) om een ​​500 mM-oplossing te verkrijgen; bewaar bij -20℃.

Aanbevolen werkconcentratie: 1 mM

Gerelateerde productinformatie

Referenties:

[1] Sato T, Stange DE, et al.Langdurige expansie van epitheliale organoïden uit de menselijke dikke darm, adenoom, adenocarcinoom en Barrett-epitheel. Gastroenterologie. 2011 nov;141(5):1762-72. doi: 10.1053/j.gastro.2011.07.050. Epub 2011 sep 2. PMID: 21889923.

[2] Lancaster MA, Renner M, et al. Cerebrale organoïden modelleren de ontwikkeling van de menselijke hersenen en microcefalie. Nature. 2013.501(7467):373-379. http://dx.doi.org/10.1038/nature12517.

[3] Greggio C, et al. Kunstmatige driedimensionale niches deconstrueren de ontwikkeling van de pancreas in vitro. Ontwikkeling. 2013.140(21):4452-4462. http://dx.doi.org/10.1242/dev.096628.

[4] McCracken KW, et al. Modellering van menselijke ontwikkeling en ziekte in pluripotente stamcel-afgeleide maagorganoïden. Nature. 2014.516(7531):400-404. http://dx.doi.org/10.1038/nature13863.

[5] Zhao B, Ni C, et al. Recapitulatie van SARS-CoV-2-infectie en cholangiocytenschade met humane leverkanaalorganoïden. Protein Cell. 2020 okt;11(10):771-775. doi: 10.1007/s13238-020-00718-6. PMID: 32303993; PMCID: PMC7164704.

[6] Qu M, Xiong L, et al. Oprichting van intestinale organoïdeculturen die letsel-geassocieerde epitheliale regeneratie modelleren. Cell Res. 2021 mrt;31(3):259-271. doi: 10.1038/s41422-020-00453-x. Epub 2021 8 jan. PMID: 33420425; PMCID: PMC8027647.

[7] BlueRock Therapeutics kondigt eerste patiënt aan die is gedoseerd met DA01 in fase 1-studie bij patiënten met gevorderde ziekte van Parkinson. BlueRock Therapeutics persbericht: 8 juni 2021.

[8] Takasato M, Er PX, et al. Nierorganoïden van menselijke iPS-cellen bevatten meerdere afstammingslijnen en modelleren menselijke nefrogenese. Nature. 2015.526(7574):564-568. http://dx.doi.org/10.1038/nature15695.

[9] Spence JR, Mayhew CN, et al. Gerichte differentiatie van menselijke pluripotente stamcellen in darmweefsel in vitro. Natuur. 2011.470(7332):105-109. http://dx.doi.org/10.1038/nature09691.