1. Lage transcriptieopbrengst

De kwaliteit van de template is nauw verbonden met de opbrengst. Als de opbrengst van de experimentele groep significant lager is dan de controlegroep, zijn de mogelijke redenen:

① het experimentele sjabloon bevat remmende componenten;

② Er klopt iets niet in de sjabloon.

Suggesties:

① Reinig de sjabloon opnieuw;

② Bepaal de sjabloonkwantificering en de integriteit ervan;

③ Verleng de reactietijd;

④ Verhoog de hoeveelheid sjablooninvoer;

⑤ Probeer andere promotoren en RNA-polymerasen.

2. Lage opbrengst van korte transcripten

Een kort transcriptie-initiatiefragment zal de reactie remmen. Wanneer het transcriptieproduct minder dan 100 nt is, zal het verlengen van de reactietijd tot 4-8 uur of het verhogen van de hoeveelheid template tot 2 μg de RNA-opbrengst verhogen.

3. De RNA-transcriptielengte is groter dan verwacht

Als uit de elektroforese blijkt dat de productband groter is dan de verwachte grootte, zijn dit de mogelijke redenen:

①Het plasmidesjabloon is mogelijk niet volledig gelineariseerd;

②Het 3'-uiteinde van de sense-streng heeft een opvallende structuur;

③Het RNA heeft een secundaire structuur die niet volledig gedenatureerd is.

Suggesties:

①Controleer of de sjabloon volledig is gelineariseerd en voer indien nodig extra linearisatie uit;

②Selecteer een geschikt restrictie-enzym om 3'-overhangen te voorkomen, of gebruik Klenow Fragment/T4 DNA-polymerase om de transcriptie te voltooien voordat u verdergaat;

③Gebruik gedenatureerde gel om RNA-producten te detecteren.

4. De RNA-transcriptielengte is korter dan verwacht

Als uit de elektroforese blijkt dat de productband kleiner is dan de verwachte grootte, zijn dit de mogelijke redenen:

①Het sjabloon bevat een terminatiesequentie die lijkt op T7 RNA-polymerase;

②Het GC-gehalte in de sjabloon is hoog.

Suggesties:

①Verlaag de reactietemperatuur (bijvoorbeeld 30°C). Soms kan het verlagen van de temperatuur de transcriptielengte vergroten, maar het zal de opbrengst verminderen. Of probeer verschillende RNA-polymerasen voor transcriptie;

②Als het GC-sjabloongehalte hoog is, gebruik dan 42℃ om te transcripteren, of voeg SSB toe om de opbrengst en transcriptielengte te vergroten.

5. Elektroforese-tailing van transcriptieproducten

Er is sprake van een staartverschijnsel tijdens elektroforese.

Mogelijke redenen:

①Verontreinigd met RNase tijdens experimentele operatie;

②Verontreinigd DNA-sjabloon door RNase.

Suggesties:

①Gebruik RNase-vrije pipetpunten en EP-buisjes, draag wegwerphandschoenen en -maskers van latex en alle reagentia worden bereid met RNase-vrij H2O.

②Zuiver het template-DNA opnieuw.

[1] Dong Z, Zheng N, Hu C, et al.Nosema bombycis microRNA-achtige RNA 8 (Nb-milR8) verhoogt de pathogeniciteit van schimmels door de genexpressie van BmPEX16 in zijn gastheer, Bombyx mori, te moduleren. Microbiol Spectr. 2021;9(2):e0104821. doi:10.1128/Spectrum.01048-21(IF:7.171)

[2] Wang X, Tang S, Ye S, et al. Ultragevoelige kwantificering van circulerende miR-195-5p met triple streng displacement amplification cascade. Talanta. 2022;242:123300. doi:10.1016/j.talanta.2022.123300(IF:6.057)