Hieff^™ Snelle cel direct RT-qPCR Kit op basis van SYBR Green-kleurstof is geschikt voor RNA-extractie uit alle soorten dierlijke cellen (zoals cellijnwandcellen en suspensiecellen, primaire kweekcellen, verschillende stamcellen, iPS-cellen, enz.), zonder dat RNA hoeft te worden geëxtraheerd, en kan direct worden gebruikt voor qPCR-expressieanalyse, die kort is, eenvoudig te bedienen en een lage foutmarge heeft. Het duurt slechts 1,5 uur om de stappen van templatevoorbereiding tot reverse transcriptiereactie en genexpressieanalyse te voltooien.

De kit bevat reagentia voor reverse transcriptie en fluorescentiedetectie, die u kunt gebruiken voor genexpressieanalyse zonder dat u extra reagentia hoeft aan te schaffen.

Specificaties

Componenten

Opslag

FCD Lysis Buffer en FCD Washing Buffer werden gesmolten en bewaard bij 4°C om besmetting te voorkomen. FCD Stop Solution, DNase I, 4× Hifair™ FCD RT Mix, 2× Hieff™ FCD qPCR SYBR Master Mix moeten worden bewaard bij -25~-15℃.

Instructies

1. Bereiding van splitsingsproducten

1)1. Smelt het reagens op kamertemperatuur, draai het ondersteboven en meng het voorzichtig voor gebruik. Gebruik het na licht centrifugeren om schuimvorming te voorkomen*.

*Als de reagentia niet worden gemengd, als er een oscillator wordt gebruikt voor het mengen en als de reagentia niet op ijs worden geconfigureerd, kan dit leiden tot een afname van de reactieprestaties.

2) Afhankelijk van het celtype**, breng de cellen over naar een centrifugebuis en centrifugeer bij 5000 rpm gedurende 2 min om de cellen te verzamelen en het medium goed te aspireren. Als de cellen worden gekweekt in 96-wells platen, kan het medium direct worden geaspireerd.

​​​​​​​3) Voeg 150 μL FCD-wasbuffer toe aan elk putje, was de cellen door te blazen, centrifugeer gedurende 2 min bij 5000 rpm en zuig de FCD-wasbuffer*** op.

​​​​​​​4) Voeg 48 μL FCD Lysis Buffer Solution en 2 μL DNase Ⅰ Solution toe aan elke well, blaas en meng bij kamertemperatuur, laat het vervolgens 5 minuten staan ​​en voeg dan 2 toe.5 μL FCD Stop Solution na incubatie****, en vervolgens ongeveer 5 keer blazen en mengen om het splitsingsproduct***** te verkrijgen.

** De basisvereiste voor het aantal cellen is 1 × 10⁴ cellen per putje, en deze kit kan worden gebruikt in het bereik van 1 × 10³ - 1 × 10⁶ cellen. Als het aantal cellen groter is, kan de hoeveelheid FCD Lysis Buffer-oplossing en DNaseⅠoplossing evenredig worden verhoogd.

*** De centrifugeeromstandigheden variëren per cel. Centrifugeer daarom met een snelheid die geschikt is voor de gebruikte cellen.

**** Voeg 2,5 μL FCD Stop Solution toe aan 50 μL lysaat en verhoog de hoeveelheid FCD Stop Solution indien nodig.

***** Voor langdurige opslag van cellyseproductoplossingen, bewaar bij -20°C.

5) Smelt 4 x Hifair™ FCD RT Mix op kamertemperatuur en meng met lichte omkering, plaats op ijs en configureer het reactiesysteem volgens de onderstaande tabel:

*******Aanbevolen gebruiksniveau is 2-5 μL, probeer 45% niet te overschrijden.

1. Omgekeerde transcriptie

Pipetteer en meng voorzichtig de hierboven bereide reactieoplossing en voer de omgekeerde transcriptiereactie uit volgens de procedure in de onderstaande tabel:

* De aanbevolen reverse transcriptietemperatuur is 55°C. Voor templates met een hoog GC-gehalte of complexe templates kan de reverse transcriptietemperatuur worden verhoogd tot 60°C. Het reverse transcriptieproduct kan direct worden gebruikt voor downstream RT-qPCR-detectie. Om de remming van de qPCR-reactie door het reverse transcriptiesysteem te voorkomen en de juiste Ct-waarde (10-35) te verkrijgen, kan het product 10-1000 keer worden verdund en vervolgens worden gebruikt. Als downstream-experimenten gedurende een korte tijd niet worden uitgevoerd, Het kan bij -20℃ worden bewaard.

1. Fluorescentie kwantitatieve PCR

1) Reactie systeem configuratie

Voor de bereiding van de reactieoplossing (bereiding op ijs) worden de volgende verhoudingen aanbevolen.

*Voeg niet meer dan 1/10 van het RT-qPCR-volume van het reverse transcriptieproduct toe. Een hoge concentratie template leidt gemakkelijk tot niet-specifieke amplificatie, geschikte verdunning van 5-50 keer. De aanbevolen hoeveelheid template is 4 μL, probeer 6 μL niet te overschrijden. Wanneer de reactieprestaties slecht zijn, kan de primerconcentratie worden aangepast in het bereik van 0,2-1,0 μmol/L.

2) Fluorescentie kwantitatieve PCR-amplificatieprocedure (tweestapsmethode)

3) Snelle amplificatieprocedure voor fluorescerende kwantitatieve PCR (tweestapsmethode)

* De annealing/extension temperatuur en de uiteindelijke extensietijd kunnen op de juiste manier worden aangepast volgens de experimentele vereisten. Het snelle programma is geschikt voor de meeste genen en het standaardprogramma kan worden geprobeerd voor individuele complexe secundaire structuurgenen.

Notities

1. Dit product is uitsluitend bedoeld voor onderzoeksdoeleinden.
2. Voor uw eigen veiligheid, draag alstublieft een labjas en wegwerphandschoenen.

Versie EN20230908

Documenten:

Handleidingen

11172-Hieff™ Snelle cel Direct. EN20230908.pdf